BPHL与PML-C间相互作用的胞内、外验证

• 作者: 刘北忠 初晨 吴燕 吴秀娟 朱丹 钟梁
• 来源期刊: 四川大学学报（医学版）
• 关键词: 人联苯样水解酶 早幼粒细胞白血病螺旋 coiled-coil结构域 蛋白质相互作用 酵母双杂交 免疫共沉淀 载体构建
• 年，卷（期）: 2013,（1）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 6-9
• 语种: 中文

摘要

目的 通过酵母双杂交实验及免疫共沉淀技术验证人联苯样水解酶(BPHL)与缺失核定位信号的人急性早幼粒细胞白血病(PML)基因的coiled-coil的结构域(PML-C)蛋白之间的相互作用.方法 将表达PML-C诱饵蛋白及BPHL靶蛋白的重组质粒pGBKT7 PML-C及pACT2-BPHL共转化AH109酵母菌,通过酵母双杂交实验验证两者在活细胞内的相互作用.构建能在人胚肾293细胞中表达带HA标签的PML-C融合蛋白的重组载体pCMV-HA-PML-C,经酶切鉴定正确后,和表达带myc标签的BPHL融合蛋白的重组真核表达载体pCMV-myc-BPHL,共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术验证BPHL与PML-C间的相互作用.结果 pGBKT7-PML-C及pACT2-BPHL质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆.构建的重组表达载体pCMV-HA-PMLC及pCMV-myc-BP HL经双酶切鉴定正确后共转染HEK293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀HA-PML-C相互作用蛋白复合物后,用抗c-myc单克隆抗体进行Western blot检测,可以检测到myc-BPHL的表达蛋白.结论 成功构建了pCMV-HA-PML-C及pCMV-myc-BP HL融合蛋白真核表达重组载体,利用酵母双杂交实验及免疫共沉淀技术证实BPHL与PML-C之间存在着相互作用.