Chk1/2转基因MGC803细胞系的建立与鉴定

• 作者: 凌晖 向姝霖 唐海林 姜浩 戴文香 苏波 苏琦 陆丽峰
• 来源期刊: 中南医学科学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: Chk基因 真核表达 转染 人胃癌MGC803细胞
• 年，卷（期）: 2013,（2）
• 所属期刊栏目: 方法技术
• 页码范围: 140-145
• 页数: 6页
• 分类号: R331|R329.2
• 字数: 3962字
• 语种: 中文

摘要

目的 构建Chk1/2基因的真核表达载体和建立高表达Chk1/2基因人胃癌MGC803细胞,为研究Chk1/2功能奠定基础. 方法 参照野生型Chk1/2基因mRNA全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点.从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成Chk1/2 cDNA第一链,并扩增目的基因全表达序列片断,双酶切后定向克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,经氨苄青霉素筛选阳性重组质粒,菌液PCR及测序法对重组质粒进行鉴定.用脂质体将重组质粒转染入MGC803细胞,经G418筛选后,RT-PCR及Western blot 检测表达产物. 结果 菌液特异性PCR结果表明克隆的基因片断分别为1.4 kb和1.6 kb,测序分别证实为Chk1和Chk2基因,经NCBIBLAST分析与Genbank中Chk1基因的同源性为100％,编码的氨基酸同源性为100％,Chk2基因的同源性为99％,编码的氨基酸同源性为100％.G418筛选转染细胞4周后获得稳定转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞克隆株和稳定转染重组质粒的MGC803细胞.经RT-PCR及Western blot鉴定,Chk1/2在MGC803细胞中的表达比对照组明显增加. 结论 成功构建Chk1/2基因真核表达载体与Chk1/2高表达MGC803细胞,为研究二烯丙基二硫诱导MGC803细胞G2/M期阻滞的机制奠定了基础.