棉铃虫酯酶突变体的构建、表达及酶促动力学特性

• 作者: 冯俊涛 吴美玲 张兴 李永强 马志卿
• 来源期刊: 浙江大学学报（农业与生命科学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: 酯酶 氨基酸突变 α-乙酸萘酯 4-硝基苯基乙酸酯 酶促动力学
• 年，卷（期）: 2014,（1）
• 所属期刊栏目: 生物科学与技术(Biological sciences & biotechnology)
• 页码范围: 16-24
• 页数: 9页
• 分类号: Q966
• 字数: 6618字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3785/j.issn.1008-9209.2012.04.062

摘要

在前期研究的基础上,基于定点突变技术在棉铃虫酯酶001F和001G的A127位和F238位分别人工构建由丙氨酸(A)变为天冬氨酸(D)、苯丙氨酸(F)变为亮氨酸(L)的单、双位点突变体,利用杆状病毒载体表达系统对其进行异源真核表达,采用酶标仪测定表达产物对α-乙酸萘酯和4-硝基苯基乙酸酯的酶促动力学参数.结果表明：酯酶A127位突变降低了酯酶的酶促水解活性,其对底物的亲和力明显减弱(反应常数Km值变大),速率常数kcat/Km值仅为突变前的1/20～1/90；F238位突变对酯酶的酶促水解作用影响相对较小,其kcat/Km值为突变前的1/2～1/7；双位点突变体(A127D/F238L)几乎全部失去了对底物的酶促水解活性,其亲和力明显下降(Km值升高至突变前的4～30倍), kcat/Km值为0.09～0.33μmol-1. s-1. L,仅为突变前的1/70～1/370.表明突变对酯酶活性有明显影响, A127位和F238位氨基酸残基是与酶催化功能相关的重要位点,这将为研究酯酶在棉铃虫代谢抗性中的作用提供一定的参考.