巢式PCR快速检测西瓜细菌性果斑病菌

• 作者: 朱艳 李敏 毕阳 王婧 盛文军 祝霞 韩舜愈
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 西瓜细菌性果斑病 西瓜种子 PCR 检测
• 年，卷（期）: 2014,（2）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 284-291
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.008

摘要

[目的]建立nested-PCR方法,快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac),为西瓜细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,WFB)的防控提供技术支持.[方法]根据Aac BOX短重复序列的PCR产物设计两对引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2,建立以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,以5μL样品处理液于99℃高温裂解10 min,再放置冰上冷却5 min,以所释放病原DNA为模板进行PCR扩增,采用50μL反应体系:5μL10×PCRbuffer (25mmol·L-1 MgCl2),4μL dNTP (D4030RA,2.5 mmol·L-1),引物(5μmol·L-1)各3μL,0.4 μL Taq DNA酶(DR001B,5U·μL-1),通过退火温度优化,反应条件为:引物BX-L1/BX-R5各3μL进行第一轮扩增,95℃,2 min; 95℃,30s;65℃,45s;72℃,1 min; 35个循环;72℃,延伸7 min;取扩增后的产物1μL为模板,以引物BX-L1/BX-S-R2各3 μL进行第二轮扩增,95℃,2 min; 95℃,30 s,66℃,45 s,72℃,1 min,30个循环,72℃,7 min.在此条件下对梯度Aac菌悬液、模拟带菌种子提取液进行特异性、灵敏性及重复性检验,对不同带菌率的西瓜种子提取液进行检测.[结果]引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2在检测不同来源的Aac菌株时都产生了预期大小的片段,并且对其近源种燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种(A.avenae subsp.cattleyae)、魔芋假单胞菌(A.avenae subsp.konjaci)及其不相关菌株未扩增出目标片段.以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,对Aac纯菌液和模拟带菌种子提取液的最低检测限4.7×101cfu/mL,比direct-PCR灵敏度高出1 000倍.当西瓜种子带菌率在0.1％-0.5％时,nested-PCR阳性检测率为66.7％;当种子带菌率为1％-10％时,nested-PCR的阳性检测率为83％-100％. [结论]以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR方法,能够快速、高效检测携带微量Aac的西瓜种子,检测结果重现性高.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	毕阳	甘肃农业大学食品科学与工程学院	295	2747	25.0	33.0
2	韩舜愈	甘肃农业大学食品科学与工程学院	119	865	15.0	20.0
3	盛文军	甘肃农业大学食品科学与工程学院	39	310	11.0	15.0
4	祝霞	甘肃农业大学食品科学与工程学院	59	506	13.0	18.0
5	李敏	甘肃农业大学食品科学与工程学院	13	102	5.0	10.0
6	王婧	甘肃农业大学食品科学与工程学院	35	144	7.0	10.0
7	朱艳	甘肃农业大学食品科学与工程学院	11	35	3.0	5.0