三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

• 作者: 徐丽慧 戴富明 曾蓉 罗金燕 陈磊 高士刚
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 黄瓜靶斑病菌 黄瓜炭疽病菌 黄瓜细菌性角斑病菌 分子检测 三重PCR
• 年，卷（期）: 2016,（16）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 3119-3129
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.006

摘要

[目的]开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法.[方法]根据ITS或16S rDNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系.[结果]针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA.引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3％琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物.在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16 μmol·L-1时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增.最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25 μ L PCR反应体系中含有12.5μ L2×HiffTMPCR Master Mix (With Dye)、0.16 μmol.L-1 CC5F/CC5R、0.4 μmol.L-1 CL3F/CL5R、0.16 μmol.L-1 PS3F/PS4R.反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min.[结论]建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μ L-1.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	戴富明	上海市农业科学院生态环境保护研究所	40	463	10.0	21.0
2	罗金燕		26	70	5.0	6.0
3	陈磊		23	57	4.0	6.0
4	高士刚	上海市农业科学院生态环境保护研究所	8	30	3.0	5.0
8	曾蓉	上海市农业科学院生态环境保护研究所	17	88	6.0	8.0
12	徐丽慧	上海市农业科学院生态环境保护研究所	8	30	3.0	5.0