Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的表达分布及对其成熟的影响

• 作者: 刘扬 昝林森 李光鹏 白春玲 银凤霞 魏著英
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: Cdc42 免疫细胞化学 显性负性突变体 体外转录 显微注射
• 年，卷（期）: 2014,（3）
• 所属期刊栏目: 畜牧?兽医?资源昆虫
• 页码范围: 574-585
• 页数: 12页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.03.017

摘要

【目的】探明Cdc42蛋白在牛卵母细胞成熟过程中的表达及分布规律，并且研究抑制Cdc42活性对于牛卵母细胞成熟的影响。【方法】首先通过收集体外成熟不同时间（0-24 h）的牛卵母细胞，用Western blotting的方法检测Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的表达量变化情况，通过免疫细胞化学的方法检测Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的分布及定位情况。根据GenBank公布的牛Cdc42基因（GenBank登录号：NM_001046332.1）的mRNA序列设计引物，并在正向和反向引物的末端分别加上KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位点，用PCR的方法扩增牛Cdc42基因的CDS区，将PCR产物和pMD19T载体连接得到野生型的克隆载体pMD19T-Cdc42WT。用定点突变引物以pMD19T-Cdc42WT为模板进行PCR反应，得到Cdc42的显性负性突变体Cdc42T17N的克隆载体pMD19T-Cdc42T17N。将pMD19T-Cdc42WT和pMD19T-Cdc42T17N分别酶切后，将Cdc42WT（775 bp）和Cdc42T17N（775 bp）片段分别连接到pcDNA3.1（+）的多克隆位点区域，得到相应的原核表达载体pcDNA3.1（+）-Cdc42WT和pcDNA3.1（+）-Cdc42T17N。用体外转录的方法分别得到Cdc42WT和Cdc42T17N的cRNA，用显微注射的方法将相应的cRNA分别注入到牛GV期卵母细胞质内，检测其成熟率的变化。【结果】①Cdc42蛋白分别在牛卵母细胞中成熟培养0、4、8、12、16、20以及24 h时表达量没有明显差异，但是其分布规律随着减数分裂的进行发生着动态的变化：Cdc42蛋白在卵母细胞皮质区域集中分布的模式在生发泡（germinal vesicle，GV）期卵母细胞中很少出现，而在第一次减数分裂中期（metaphase Ⅰ，MⅠ）卵母细胞中出现得最多也最为明显；Cdc42蛋白在染色体附近的皮质富集的现象开始出现于前中期（pro-metaphase Ⅰ，pMⅠ），并且出现频率从pMⅠ期到第2次减数分裂中期（metaphase Ⅱ，MⅡ）逐渐增多；Cdc42蛋白和纺锤体重叠定位的现象在第1次减数分裂后期（anaphase Ⅰ，AⅠ）到末期（telophaseⅠ，TⅠ）的卵母细胞中占有有很高比例，而到MⅡ期时这种现象又很少出现。②从牛卵母细胞的总cDNA中扩增Cdc42基因得到785 bp的片段，构建的牛Cdc42的野生型及其显性负性突变体的克隆载体pMD19T-Cdc42WT和pMD19T-Cdc42T17N经酶切鉴定和以及测序比对后，符合预期结果，即成功克隆了牛野生型Cdc42基因并得到其显性负性突变体Cdc42T17N；③构建的相应的原核表达载体pcDNA3.1（+）-Cdc42WT和pcDNA3.1（+）-Cdc42T17N经酶切鉴定和测序比对，符合预期结果，经过体外转录均得到一个3079 bases和987 bases的RNA片段，符合预期结果，即成功构建了相应的原核表达载体并获得相应的cRNA；④与正常成熟培养组和注射Cdc42WTcRNA的牛卵母细胞相比，注射Cdc42T17NcRNA的成熟率显著降低（P<0.05）。【结论】卵母细胞在卵泡发育过程中就已经积累了足够的Cdc42蛋白，而在减数分裂过程中Cdc42可以在卵母细胞的皮质以及纺锤体的位置发挥作用，而且正常的Cdc42活性是牛卵母细胞完成成熟过程并排出第一极体所必需的。