徐淮山羊多能性转录因子mRNA制备及在成纤维细胞中的表达

• 作者: 倪蓉 张亚妮 李伟 李碧春 邱峰龙 陈庭锋 韦光辉
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 徐淮山羊 多能性转录因子 体外转录 mRNA
• 年，卷（期）: 2014,（7）
• 所属期刊栏目: 畜牧?兽医?资源昆虫
• 页码范围: 1417-1426
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.019

摘要

【目的】克隆徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的CDS片段，构建pMD19-T-oct4、pMD19-T-sox2、pMD19-T-klf4和pMD19-T-c-myc重组质粒，随后构建含T7启动子的pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc重组质粒，通过体外转录，获得该4种多能性转录因子的mRNA，并使其在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达。【方法】应用RT-PCR方法分别从徐淮山羊睾丸组织、皮肤组织、小肠组织中扩增多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因编码全序列，将该4种基因分别克隆到pMD19-T载体，构建pMD19-T-oct4、pMD19-T-sox2、pMD19-T-klf4和pMD19-T-c-myc重组质粒。然后将pcDNA3.0载体和pMD19-T重组载体双酶切后用T4连接酶连接，构建含有T7启动子的真核表达载体pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc重组质粒。各重组质粒分别用限制性内切酶XhoI、XbaI单酶切，酶切后质粒模版按照体外转录试剂盒说明体外转录获得各多能性转录因子的mRNA，并对获得的mRNA进行检测，确定其稳定性和浓度。按照脂质体（体积）﹕mRNA （质量）为1﹕1的比例用脂质体2000转染。转染24 h后，利用Western blot技术、间接免疫荧光实验检测徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的mRNA在成纤维细胞中的表达。【结果】①克隆得到的徐淮山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因编码序列全长分别为1083、962、1434和1320 bp，并经TA克隆测序验证，其CDS 序列与绵羊、人、牛和猪等的序列相似性在89%以上；②体外转录获得的4种多能性转录因子的mRNA经脂质体转染徐淮山羊成纤维细胞，在成纤维细胞中均定位于细胞核；③4种多能性转录因子的mRNA在徐淮山羊成纤维细胞中表达的蛋白与预期大小一致，分别为38、34、50和48 kd。【结论】成功克隆了徐淮山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因，该4种多能性转录因子的mRNA能够在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达，为进一步研究Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的功能和山羊体细胞的重编程奠定基础。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李碧春	扬州大学动物科学与技术学院	189	1267	18.0	27.0
2	李伟	扬州大学动物科学与技术学院	59	185	8.0	10.0
3	张亚妮	扬州大学动物科学与技术学院	40	56	4.0	6.0
4	倪蓉	扬州大学动物科学与技术学院	5	19	2.0	4.0
5	邱峰龙	扬州大学动物科学与技术学院	7	15	3.0	3.0
6	韦光辉	扬州大学动物科学与技术学院	6	9	1.0	3.0
7	陈庭锋	扬州大学动物科学与技术学院	5	7	2.0	2.0