沉默过氧化物酶体增殖子活化受体γ表达降钙素基因相关肽基因重组载体的构建与鉴定

• 作者: 孙俊魁 施佳辰 李劲峰 李宁博 李月白 王义生 赵国强
• 来源期刊: 中华实验外科杂志
• 关键词: RNA干扰 过氧化物酶体增殖子活化受体-γ 降钙素基因相关肽 重组载体
• 年，卷（期）: 2014,（1）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 142-145
• 页数: 4页
• 字数: 3631字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2014.01.049

摘要

目的 构建与鉴定沉默过氧化物酶体增殖子活化受体γ(PPARγ)同时表达降钙素基因相关肽(CGRP)基因重组载体.方法 选用pGFP-V-RS载体,将PPARγ小干扰RNA(siRNA)寡核苷酸靶序列连接入pGFP-V-RS载体,酶切鉴定及测序正确后得到重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ;将CGRP片段与Mlu Ⅰ酶切,并与末端羟基化的线性质粒pGFP-V-RS重组连接,得到重组载体pGFP-V-RS-exCGRP.将获取的CGRP基因片段连接入线性化重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ,酶切鉴定及测序正确后得到重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP.收集第3代HEK-293细胞,将细胞分为4组:CON组:转染空载体pGFP-V-RS质粒,作为对照；SI组:转染重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ质粒；EX组:转染重组pGFP-V-RS-exCGRP质粒；DOU组:转染重组双基因载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP质粒.每组电极杯中加入5x106个细胞,并分别加入上述质粒2.5μl,给予直流电低压脉冲1次,时间15 ms.培养48 h后收集各组细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与Western blot检测细胞内PPAR、CGRP mRNA及蛋白的表达.结果 重组双基因载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP经酶切鉴定及测序结果与设计完全一致.电转染HEK-293细胞后,DOU组细胞PPARγ基因呈低表达,PPARγmRNA与其蛋白的相对表达量为0.036±0.003、0.108 ±0.031,与EX组(0.156±0.014、0.778±0.103)及CON组(0.148±0.014、0.742 ±0.143)比较,差异有统计学意义(P＜0.05),与SI组(0.054±0.005、0.135 ±0.039)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).DOU组细胞CGRP基因呈高表达,CGRP mRNA与其蛋白的相对表达量为1.144±0.106、1.244±0.184,与SI组(0.320±0.030、0.370±0.089)及CON组(0.444 ±0.041、0.274±0.062)比较,差异有统计学意义(P＜0.05),与EX组(1.021 ±0.095、1.221±0.181)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建出沉默PPARγ基因并表达CGRP基因的重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP,能够有效阻断PPARγ基因表达,同时促进CGRP基因表达.