利用9R-GFP-PHD检测细胞膜上PIP2的动态变化

• 作者: 万玉英 危永芳 张剑锋 杨章坚 韩小建
• 来源期刊: 重庆医学
• 关键词: C型磷脂酶类 穿膜多肽 普列克同源域 磷脂酰肌醇4,5-二磷酸 肌醇1,4,5-三磷酸
• 年，卷（期）: 2014,（18）
• 所属期刊栏目: 论著?基础研究
• 页码范围: 2308-2311
• 页数: 4页
• 字数: 2625字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-8348.2014.18.017

摘要

目的：通过原核细胞表达和纯化9R-GFP-PHD重组蛋白，并利用纯化后的9R-GFP-PHD蛋白来检测与磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）和 IP3的结合能力以及细胞膜上 PIP2的动态变化。方法通过分子克隆技术将磷脂酶 C-δ1的普列克同源域（PHD）、荧光蛋白 GFP及细胞穿膜多肽9R融合以构建相应蛋白表达载体。利用原核表达体系 BL21大肠埃希菌和镍柱进行重组蛋白的表达和纯化，其中 GFP和9R-GFP为9R-GFP-PHD的对照蛋白。获取重组蛋白后，通过同位素实验和液体闪烁计数器，分别检测和比较 GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD与[3H]标记的 PIP2和 IP3的结合能力以及之间的竞争性抑制。另外，利用MDCK细胞检测和比较孵育的 GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD后，3种重组蛋白在细胞内的分布情况。通过图片相减处理和荧光实时定量分析 MDCK细胞膜上的9R-GFP-PHD在 ATP刺激后分布的动态变化，从而间接反映细胞膜上 PIP2的水解变化。结果通过原核表达和镍柱纯化体系顺利获得了GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD重组蛋白。体外结合实验证实9R-GFP-PHD与PIP2和IP3均有很强的结合能力，而且IP3能竞争性抑制9R-GFP-PHD与PIP2的结合。在孵育了3种荧光融合蛋白后，荧光共聚焦显微镜观察发现9R-GFP 主要分布在细胞质中，而9R-GFP-PHD特异性分布于细胞膜上。荧光实时定量分析显示，ATP刺激通过P2y受体激活磷脂酶C以水解 PIP2，从而使 MDCK细胞膜上的9R-GFP-PHD减少20％左右。结论本研究中构建的9R-GFP-PHD利用了细胞穿膜多肽、PHD与 PIP2和 IP3结合特性及 GFP 的荧光可视和定量分析特性，有效地检测细胞膜上PIP2的动态变化，将为今后进一步研究细胞内钙动员提供新的工具蛋白。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	张剑锋	南昌大学转化医学研究院	7	14	2.0	3.0
2	韩小建	南昌大学转化医学研究院	4	69	2.0	4.0
3	万玉英	南昌大学第二附属医院感染管理科	10	112	4.0	10.0
4	危永芳	南昌大学转化医学研究院	1	0	0.0	0.0
5	杨章坚	南昌大学转化医学研究院	1	0	0.0	0.0