小鼠 pLCK-CD69-IRES-EGFP 表达载体构建及C D69转基因小鼠的建立

• 作者: 朱狄峰 汪慧英 王佳佳 王静 翁勤洁 胡燕 谭笔琴 赵梦婷
• 来源期刊: 浙江大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: 抗原 核糖体 绿色荧光蛋白质类/代谢 质粒 转染 小鼠,转基因
• 年，卷（期）: 2015,（5）
• 所属期刊栏目: 专题报道
• 页码范围: 511-516
• 页数: 6页
• 分类号: R394.8
• 字数: 3663字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3785/j.issn.1008-9292.2015.09.07

摘要

目的：构建携小鼠细胞表面活化蛋白CD69和增强型绿色荧光蛋白（ EGFP）在细胞内核糖体切入位点（ IRES）的表达载体pLCK-CD69-IRES-EGFP，并基于此创建CD69转基因小鼠。方法：首先通过小鼠肺组织提取RNA，逆转录成为cDNA，经过PubMed搜索设计PCR引物，PCR法扩增mCD69片断，接着将该DNA片段经测序验证后接入pInsulater-LCK-IRES-EGFP质粒，构建pLCK-CD69-IRES-EGFP转基因载体；再将其转染到293 T 细胞中，通过荧光显微镜技术确定其在293 T细胞中的表达状况；最后将载体显微注射入受精卵并移植入假孕母小鼠，出生小鼠取尾经PCR鉴定获得阳性首建鼠，并通过荧光显微镜和流式细胞术确定淋巴细胞上 CD69的表达。结果：经酶切、DNA 测序鉴定证实 pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体构建成功；荧光倒置显微镜检查证实其在转染的293 T细胞内的蛋白表达；小鼠取尾PCR鉴定明确CD69转基因小鼠创建成功；CD69转基因小鼠有外周血淋巴细胞的减少及静息状态下CD69的表达。结论：成功构建pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体及制备CD69转基因小鼠，为CD69在炎症性疾病中作用的整体模型研究奠定了基础。