H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法的建立

• 作者: 亓文宝 和君 廖明 李华楠 李芳 穆光慧 罗开健 黄丽红
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: H9亚型禽流感 电化学发光免疫方法 快速检测
• 年，卷（期）: 2015,（15）
• 所属期刊栏目: 专题:流感病毒对人类和畜牧业健康的影响
• 页码范围: 3064-3070
• 页数: 7页
• 语种: 中文

摘要

【目的】H9亚型禽流感是重要的人兽共患性传染病，该亚型病毒为H7N9亚型和H10N8亚型流感病毒提供了6个内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS），并且一直处于动态重组过程中。因此，建立针对H9亚型禽流感的型特异性电化学发光免疫的高通量快速检测方法，加强H9亚型流感的监测，具有重要意义。【方法】用钌联吡啶标记H9亚型AIV的单克隆抗体，用MPI-E型电致化学发光分析系统评价钌标单抗标记效率；用生物素标记H9亚型AIV的多克隆抗体，HABA法检测抗体生物素化的效率；待测抗原与钌标单抗作用1 h后，将此抗原-抗体复合物与通过生物素-链霉亲和素系统固定在磁微球表面的多克隆抗体反应，最后加入反应底物三丙胺后即可在电化学分析系统进行发光检测。优化生物素化多抗和钌标单抗最佳工作浓度，确定临界值和反应谱，对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性试验。攻毒后3 d和5 d，采集攻毒组和空白对照组鸡只的88份咽拭子和肛拭子，分别用电化学发光免疫检测方法和鸡胚病毒分离法进行检测和比较。【结果】钌标抗H9亚型AIV单克隆抗体的标记效率为每个单抗IgG分子上结合21个Ru2+，且间接免疫荧光方法证明其仍具有生物活性；生物素化兔抗 H9N2亚型 AIV 多克隆抗体的标记效率为每个 IgG 分子上结合了6个生物素分子，且 Western blotting试验证明其仍保持生物活性；该方法的检测临界值为28.3，可疑区间为23.4—33.2；阴性和阳性变异系数均小于10%；检测限为5×104EID50，能够特异性地检测H9亚型AIV，不与其他亚型流感病毒（H1、H3、H4、H5和H6亚型）和其他类型的禽源病毒（NDV、IBV和IBDV）反应。3 h内即可完成检测，与鸡胚病毒分离法的符合率为86.4%。【结论】所建立的H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法可以用于临床样品检测，对H9亚型禽流感的监测和防控具有重要意义。