黄瓜T-DNA插入突变体库的构建

• 作者: 娄群峰 孟永娇 张璐 李季 李蕾 钱春桃 陈劲枫
• 来源期刊: 南京农业大学学报
• 学科: 农学
• 关键词: 黄瓜 T-DNA 插入突变 转基因 pROK2载体
• 年，卷（期）: 2016,（1）
• 页码范围: 40-47
• 分类号: S642.2
• 语种: 中文
• DOI: 10.7685/jnau.201504014

摘要

[目的]为了进一步研究黄瓜基因的功能,本文构建了黄瓜T-DNA插入突变体库.[方法]以黄瓜栽培品种‘长春密刺’子叶节为转化外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法,将T-DNA插入突变载体pROK2后转化黄瓜;通过筛选压力梯度试验,确定遗传转化体系最适合的卡那霉素(Kan)筛选浓度;使用PCR检测和斑点杂交方法鉴定T0和T1代转化植株;以‘长春密刺’植株为对照,统计T1代植株表型.[结果]确定100 mg· L-1为最适合的Kan抗性芽筛选浓度.T0代植株PCR检测结果初步证明,pROK2成功整合到14S1和14S2两个T0代株系基因组中.14S1自交后获得55个T1代单株,对其进行PCR检测,发现其中12个单株均扩增出了35S和NPT-Ⅱ片段.以Dig标记的35S和NPT-Ⅱ为探针,对这12个单株及随机从剩余T1代中选取的11个单株进行斑点杂交检测,得到了2个含有35S和NPT-Ⅱ杂交信号的单株:14S1-27和14S1-34.性状调查统计显示:T1代植株在生长各阶段相对于野生型无明显突变表型.[结论] pROK2重组质粒成功整合到了14S1株系的基因组中.对14S1自交后代的PCR检测和斑点杂交检测结果进一步证明了14S1为转化植株,确定14S1为插入突变体.结合T-DNA插入位点鉴定技术可进一步开展相关基因分离及功能研究工作.