绵羊肺炎支原体hlyA基因的表达及活性初步鉴定

• 作者: 何玉龙 孙远航 李敏 王晶 王玉炯 罗海霞 郝秀静
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 绵羊肺炎支原体(MO) 溶血素(hlyA) 密码子优化 溶血活性
• 年，卷（期）: 2016,（3）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 435-442
• 分类号: S852.62
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2016.03.015

摘要

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)可引起绵羊(Ovis aries)及山羊(Capra hircus)的支原体性肺炎,分布广泛,危害严重.本实验在课题组前期完成MO Y98株基因组测序的基础上,通过基因注释、PCR等获得了该菌株可能的溶血素(hemolysin,hlyA)基因;依据大肠杆菌(Escherichia coli)优势密码子对hlyA基因进行优化,构建优化后hlyA原核表达质粒pET32a-hlyA;将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,获得了相应的重组菌株,并对重组菌株进行诱导表达;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定,并经Ni2+金属螯合柱纯化.克隆了MO hlyA基因序列(GenBank登录号:KT598390),片段大小为375 bp,编码125个氨基酸.优化后密码子适应指数为0.91,目的基因适于在大肠杆菌中表达.重组融合蛋白多以包涵体的形式存在,其相对分子质量约为31.6 kD,与预期大小一致.Western blot结果显示,上清中纯化出的目的蛋白能与一抗发生反应,重组蛋白特异性较好.溶血实验表明,当纯化后蛋白浓度稀释到0.125 μg/mL时,溶解红细胞的能力已经下降.该研究结果为后续绵羊肺炎支原体致病性研究提供了基础资料.