刚地弓形虫入侵宿主细胞过程中棒状体蛋白16的分泌与分布

• 作者: 何成 夏菁 姜诗晨 彭鸿娟 邓胜群 魏海霞
• 来源期刊: 中国寄生虫学与寄生虫病杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 刚地弓形虫 棒状体蛋白16 多克隆抗体 制备 实时荧光定量PCR 间接免疫荧光 蛋白质印迹
• 年，卷（期）: 2016,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 189-195
• 分类号: R382.5
• 语种: 中文

摘要

目的 观察刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)不同毒力株的棒状体蛋白16 (ROP16)在入侵宿主细胞过程中的分泌及分布. 方法 以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增Tgrop 16基因,克隆至pET-32a(+)载体,在大肠埃希菌(Escherichiacoli) BL21 (DE3)中经异丙基币-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.重组蛋白TgROP16经纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗TgROP16多克隆抗体,用蛋白质印迹(Western blotting)和间接ELISA检测抗TgROP 16多克隆抗体的特异性和敏感性.用实时荧光定量PCR (real-time PCR)检测刚地弓形虫RH株和Pru株速殖子Twop16基因的转录水平,Western blotting分析RH株和Pru株TgROP16蛋白的表达量.用间接免疫荧光(IFA)检测弓形虫RH株和Pru株速殖子在入侵人包皮成纤维细胞(HFFs细胞)过程中,TgROP16蛋白在宿主细胞中的分泌与分布. 结果 制备的抗TgROP16多克隆抗体,Western blotting分析结果显示,能与重组蛋白TgROP16结合,在相对分子质量(Mt)约100 000处有一特异性条带;间接ELISA检测结果显示,抗体效价为1∶25 600.实时荧光定量PCR检测结果显示,Pru株Tgrop 16基因表达量(7.786±0.206)是RH株(1.000±0.110)的7倍(P＜0.05).Western blotting分析结果显示,RH株中TgROP16蛋白表达量(TgROP16与其内参TgTubulin的灰度比值为0.373)较高于Pru株(TgROP16与其内参TgTubulin的灰度比值为0.232).IFA检测结果显示,RH株和Pru株速殖子在入侵HFFs细胞前,TgROP 16蛋白定位于速殖子的顶端复合体,速殖子入侵HFFs细胞后,TgROP16蛋白显示在虫体外. 结论 制备的抗TgROP16多克隆抗体特异性和敏感性高;刚地弓形虫RH株速殖子的TgROP16蛋白表达量高于Pru株的;两株速殖子在入侵HFFs细胞前,TgROP16蛋白分布于速殖子顶端复合体,在入侵宿主细胞过程中被分泌出虫体.