鸭瘟病毒单抗的制备及胶体金试纸条检测方法的建立

• 作者: 刁有祥 张璐 张英 提金凤 李川川 杨国平 赵丹丹 陈浩
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 鸭瘟病毒 gB蛋白 原核表达 单克隆抗体 胶体金试纸条
• 年，卷（期）: 2016,（14）
• 所属期刊栏目: 专题:水禽传染病
• 页码范围: 2796-2804
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.013

摘要

[目的]鸭瘟(DP)是由鸭瘟病毒(DPV)引起的一种急性、败血性传染病,以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡,头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征.该病一旦发生,发病急、死亡快、死亡率高,对养鸭业危害严重.快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一,可以及时确定病原,以便采取有效的防制手段.试验旨在建立鸭瘟病毒(DPV)胶体金快速检测方法.[方法]利用生物学软件Protean分析,选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物,PCR扩增目的基因.连接到载体pMD-18T上,测序正确后再连接到原核表达载体pET-28a上.将获得的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞中进行诱导表达.表达的蛋白经纯化后测其浓度并经Western blotting鉴定分析.以表达的DPV-gB蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,获得DPV-gB特异性单克隆抗体.采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以制备的H6F6单抗作为标记抗体(标记的最适pH为8.0-8.5,最佳标记浓度为1 5倍原液稀释),将纯化的A8D7单抗(浓度为2倍原液稀释)和羊抗鼠IgG(浓度为10倍稀释)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线和质控线,经条件优化建立了鸭瘟病毒胶体金试纸条检测方法.[结果]共获得4株能稳定分泌抗DPV-gB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6.间接ELISA检测腹水效价分别为1:103、1:103、1:105、1:103.亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链.Western blotting结果显示4株单抗均能与DPV-gB蛋白特异性结合.IFA结果显示制备的4株单抗是针对DPV产生的.建立的胶体金试纸条方法能够特异性地检测鸭瘟病毒,与鸭坦布苏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、呼肠孤病毒、减蛋综合征病毒无反应.阳性尿囊液稀释50倍后用该试纸条检测依然为阳性;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异.利用制备的胶体金试纸条和PCR方法对38份临床样品进行检测比较,结果显示两者符合率为91.6％.[结论]本研究建立的试纸条检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,可用于DPV的快速检测.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刁有祥	山东农业大学动物科技学院	182	1328	18.0	28.0
2	张璐	山东农业大学动物科技学院	25	276	9.0	16.0
3	赵丹丹	山东农业大学动物科技学院	12	148	7.0	12.0
4	杨国平	山东农业大学动物科技学院	5	23	3.0	4.0
5	陈浩	山东农业大学动物科技学院	18	113	7.0	10.0
6	提金凤	山东农业大学动物科技学院	11	35	4.0	5.0
7	张英	山东农业大学动物科技学院	4	21	3.0	4.0
8	李川川	山东农业大学动物科技学院	3	14	2.0	3.0