绵羊卵丘-卵母细胞复合体石蜡切片技术的改良

• 作者: 于泊洋 刘星宇 李海军 杜晨光 段云娇 王秀梅 翁娅政
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 绵羊 卵丘-卵母细胞复合体仿组织 卵巢组织 石蜡切片 蛋白表达
• 年，卷（期）: 2017,（8）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 1543-1550
• 页数: 8页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.018

摘要

[目的]在绵羊有腔卵泡发育过程中,多层卵丘细胞紧密包绕着卵母细胞形成卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex,COCs)特殊结构,存在于卵泡腔内.卵泡成熟后,绵羊COC从卵泡内排出,进入输卵管,等待受精.现有的卵丘-卵母细胞复合体蛋白鉴定技术,或者将包含各级卵泡的卵巢组织直接进行切片处理,或者将COCs从卵泡内分离,在完整卵丘-卵母细胞复合体水平上进行免疫染色.但这两种方法在检测绵羊有腔卵泡COCs中目的蛋白表达时,存在显著缺陷.研究旨在对常规石蜡组织切片技术进行改进,以期满足绵羊COCs蛋白鉴定需求.[方法]首先采用抽吸法从绵羊有腔卵泡内获得COCs,以石蜡包埋方式人为构建了一种可以进行切片处理的“包含多枚绵羊卵丘-卵母细胞复合体的仿组织结构”.然后以该特殊结构与健康绵羊卵巢组织为研究对象,分别采用改良与传统的石蜡组织免疫化学技术流程,检测了目的蛋白,尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)与其受体(urokinase-type plasminogen activator recepter,uPAR),在绵羊COCs中的表达情况,比较了两种技术的免疫染色效果与染色流程差异.[结果]将所构建的绵羊COCs仿组织结构与正常绵羊卵泡组织,进行石蜡组织切片处理,经切片、贴片与脱蜡等步骤,分别形成了散在分布于载玻片上的COCs薄片与包含卵泡的卵巢组织薄层(厚度5μm).经间接免疫染色处理后,结果显示:①目的蛋白在两种结构COCs中的表达是一致的,即uPAR在绵羊卵丘与卵母细胞上都有表达,而uPA只存在于绵羊卵丘细胞中;②在绵羊COCs薄片结构中,COCs整体形态完好,卵母细胞与外围卵丘细胞层次清晰,蛋白定位清楚,染色效果良好;在卵巢薄层结构中,绵羊卵泡内壁颗粒细胞与COCs等形态结构相对完整,卵母细胞蛋白定位清楚,但是卵丘细胞层次与蛋白表达较不清晰;③与绵羊卵巢组织石蜡切片技术相比较,绵羊COCs仿组织结构石蜡切片技术,在固定、脱水、透明、浸蜡以及脱蜡等步骤的处理时间都大大缩短,例如固定处理由24h缩短为2h;由逐级脱水的10h缩短为两级脱水的1h;透明由30min缩短为10min;软蜡与硬腊浸入由原来的6h缩短为1h;由逐级脱蜡的25min缩短为两级脱蜡的10min等.[结论]改进后的COCs仿组织石蜡切片染色技术,显示更优质的免疫定位与染色效果,不仅具有COCs获得率高、卵母与卵丘细胞形态层次清晰等优点,而且显著缩短了操作时间,简化了操作流程.该技术在保留COCs结构完整的基础上,有效检测了目的蛋白在绵羊卵丘-卵母细胞复合体中的表达模式,对于探明绵羊卵泡发育与卵母细胞成熟机制,具有重要意义.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李海军	内蒙古农业大学兽医学院	63	160	6.0	10.0
2	杜晨光	内蒙古农业大学兽医学院	45	106	6.0	8.0
3	于泊洋	内蒙古医科大学心身医学研究室	10	12	2.0	3.0
4	王秀梅	内蒙古农业大学兽医学院	21	116	5.0	10.0
5	段云娇	内蒙古农业大学兽医学院	1	2	1.0	1.0
6	刘星宇	内蒙古农业大学兽医学院	1	2	1.0	1.0
7	翁娅政	内蒙古农业大学兽医学院	1	2	1.0	1.0