酰基CoA连接酶DptE及其突变体DptE-296的克隆、初步分离纯化与鉴定

• 作者: 吴旻 王旻 王露璇
• 来源期刊: 药物生物技术
• 学科: 生物学
• 关键词: 酰基CoA连接酶 定点突变 大肠杆菌 分离纯化 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质印迹法
• 年，卷（期）: 2017,（1）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 1-4
• 页数: 4页
• 分类号: Q785
• 语种: 中文
• DOI: 10.19526/j.cnki.1005-8915.20170101

摘要

通过PCR方法扩增达托霉素生物合成相关的酰基CoA连接酶DptE及其突变体dptE-296的基因片段,经限制性内切酶bamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切后插入到原核表达载体pet22b,利用质粒自带的氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,并进行菌液PCR和测序鉴定;将测序正确的重组质粒通过热击法转入BL21(DE3)表达菌株,IPTG诱导蛋白表达,渗透压休克法提取周质蛋白,镍柱亲和纯化,通过SDS-PAGE,Western blot鉴定蛋白表达;连接生物素,通过Fortebio检测蛋白和底物癸酸的结合.测序结果显示成功构建重组载体DptE-pet22b和DptE-296-pet22b,SDS-PAGE和Western blot结果显示表达产生的蛋白大小与预期一致,Fortebio实验显示DptE及其突变体DptE-296对底物癸酸有结合,但结合的不强.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王旻		170	1536	20.0	32.0
2	吴旻		8	42	3.0	6.0
3	王露璇		1	0	0.0	0.0