尼罗罗非鱼无乳链球菌基因缺失株△cpsE和△neuA的构建及其生物学特性

• 作者: 卢迈新 叶星 孙成飞 师红亚 张德锋 曾庆凯 田园园 董浚键
• 来源期刊: 中国水产科学
• 学科: 农学
• 关键词: 尼罗罗非鱼 无乳链球菌 荚膜多糖合成基因 基因敲除 生物学特性
• 年，卷（期）: 2017,（5）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 977-987
• 页数: 11页
• 分类号: S917
• 字数: 8144字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3724/SP.J.1118.2017.17131

摘要

为探究尼罗罗非鱼无乳链球菌(GBS)荚膜多糖合成基因cpsE和neuA对菌株生物学特性的影响,本研究利用同源重组的方法,构建了GBS的cpsE与neuA的单基因缺失突变株.具体方法为:用Infusion-PCR的方法分别构建带有氯霉素抗性基因的cpsE与neuA基因敲除重组质粒pSET4s-cpsE和pSET4s-neuA.将构建好的质粒电转化入GBS感受态细胞中,通过改变培养温度实现双交换和质粒丢失,最后经氯霉素抗性筛选获得疑似敲除株.通过菌落PCR、RT-PCR及DNA测序等方法对疑似敲除株进行验证.结果显示GBS的两个突变株△cpsE和△neuA被成功构建.在此基础上,通过生物学功能分析比较基因缺失突变株△cpsE、△neuA与野生株在菌株生长速率、荚膜多糖厚度、唾液酸含量和毒力方面的差异.结果发现缺失突变株△cpsE和△neuA的生长速度与野生株无显著差异,但荚膜多糖厚度、唾液酸含量和菌株毒力均显著低于野生株.进一步研究显示,cpsE是鱼源GBS荚膜多糖合成的关键基因,neuA基因则是荚膜多糖唾液酸化的关键基因,它们的缺失导致了GBS荚膜唾液酸含量的降低,且显著降低了菌株的毒力.