朱砂叶螨β-COP和Sro基因鉴定及其沉默致死效果

• 作者: 何林 刘家路 敖已倩云 潘宇 王梦瑶 申光茂
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 朱砂叶螨 RNA干扰技术 致死效应 综合绿色防控
• 年，卷（期）: 2017,（18）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 3529-3539
• 页数: 11页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.18.009

摘要

[目的]明确朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)β-COP和Sro两条基因分子生物学信息,并基于优化的RNAi体系评价它们的致死效应,为筛选适用于RNAi防控的靶基因打下基础.[方法]首先克隆目的基因的全长,并通过序列的同源比对、保守区域及蛋白结构预测以及系统进化树的构建明确其分子生物学信息;其次通过减少dsRNA降解因素、并适时补充dsRNA等方法改进朱砂叶螨的RNAi体系,从而延长干扰时间.利用定量PCR技术检测特定时间点的沉默效率,评价优化RNAi体系后的沉默效果;最后在沉默目的基因β-COP和Sro后,检测朱砂叶螨在各特定时间点的死亡率,评价目的基因在RNAi下的致死效果,并观察相应的致死表型.[结果]β-COP开放阅读框长度为2688 bp,编码895 aa,属于"WD40 superfamily"及"Coatomer_WDAD superfamily",包含了"WD 40"和"Coatomar_WDAD"的保守区域.Sro的开放阅读框长度为1119 bp,编码372 aa,具有典型的短链脱氢酶所特有的两个特征,即与NADP+biding结合位点基序"TGxxxGx"和"YxxxK"及其上游的天冬氨酸(Asn)、丝氨酸(Ser)活性位点.优化后的RNAi体系可在96 h内能稳定保持50%左右的沉默效率,使用该方法干扰朱砂叶螨β-COP和Sro两条致死基因48 h后试验组与对照组的死亡率均有显著性差异,用β-COP的dsRNA片段干扰雌成螨108 h后,死亡率达57.4%;用Sro的dsRNA片段干扰若螨96 h后,死亡率达28.8%.死亡个体均具有明显的表型,β-COP试验组死亡表型为4对足蜷缩在体侧;Sro试验组则在静伏期死亡或在蜕皮过程中无法蜕皮而死亡.[结论]优化的朱砂叶螨RNAi技术有稳定持续的沉默效果.β-COP和Sro与RNAi技术相结合,验证了这两条目的基因的沉默可对朱砂叶螨产生一定的致死效应,表明此类基因与技术加成的模式极具开发和利用的潜力,为今后基因功能验证和筛选以及开发以RNAi技术为基础的朱砂叶螨防控方法提供了依据.