山羊睾丸支持细胞的培养与双荧光自噬报告载体的建立

• 作者: 万永杰 姚晓磊 庞静 张国敏 张艳丽 杨花 王锋 韩乐
• 来源期刊: 南京农业大学学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 自噬 睾丸支持细胞 微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3) 山羊
• 年，卷（期）: 2018,（1）
• 所属期刊栏目: 动物科学
• 页码范围: 132-139
• 页数: 8页
• 分类号: Q812
• 字数: 6013字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7685/jnau.201612007

摘要

[目的]本试验旨在建立一个实时追踪山羊细胞自噬发生状况的工具,以探讨细胞自噬对睾丸支持细胞(SC)和生殖细胞的影响.[方法]通过PCR法扩增mCherry-EGFP-LC3基因序列1884 bp,将其导入真核表达载体pEX-3中,得到重组质粒pmCherry-EGFP-LC3;将pmCherry-EGFP-LC3及对照质粒pEX-3分别转染体外分离培养的山羊SC,饥饿处理12 h后用荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的表达,用RT-qPCR和Western blot 检测细胞中自噬相关基因和蛋白表达变化,用透射电镜观察细胞自噬体的形成.[结果]成功构建了双荧光自噬报告载体,该载体能在山羊SC中表达,荧光显微镜下可见绿色荧光和红色荧光表达;饥饿处理后,该载体可以指示细胞中自噬泡的形成过程,且细胞自噬相关标记Beclin1 mRNA以及LC3Ⅱ/LC3ⅠmRNA比值和蛋白水平均显著上调,并能观察到初始自噬体的形成.[结论]获得的山羊SC可以作为后续试验的细胞模型;构建的双荧光pmCherry-EGFP-LC3自噬报告载体可为进一步研究山羊SC的自噬发生提供有效的工具.