甘精胰岛素肽图分析方法研究

• 作者: 张伟 张慧 李懿 李晶 杨慧敏 梁成罡 王绿音
• 来源期刊: 生物技术通讯
• 学科: 医学
• 关键词: 甘精胰岛素 肽图分析 酶解条件 高效液相色谱法 液质联用 方法学验证
• 年，卷（期）: 2018,（5）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 667-676
• 页数: 10页
• 分类号: R932
• 字数: 6755字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2018.05.015

摘要

目的:探索并确定甘精胰岛素的最佳酶解条件,建立酶解更完全、特异性更强的甘精胰岛素肽图分析方法.方法:采用0.4 mol/L Tris-HCl(pH9.0)溶液作为酶解缓冲液,V8蛋白酶与甘精胰岛素之比为1 U:10 μg,于37℃反应1h后加入磷酸终止反应,采用RP-HPLC分离目标肽段,采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法鉴定酶解产生的肽段.结果:甘精胰岛素基本完全酶解,未消化的主成分较《欧洲药典》9.5版(EP9.5)方法大幅减少,时间缩短了1/2,酶解的完全性与有效性大幅提高.产生的4个目标肽段可通过RP-HPLC清晰呈现并有效分离,肽段Ⅱ和Ⅲ的分离度大于25.0,拖尾因子均小于1.5,且各肽段与对照品的相对保留时间在1.00±0.01范围内.4个目标肽段和2个非特异肽段均由质谱鉴定出.较好地克服了现行EP9.5甘精胰岛素分析方法酶解反应的完全性较差、非特异酶解肽段含量较高、理论目标肽段Ⅳ及Ⅰ含量过低等不利于表征目标肽段并确证其氨基酸序列正确性的缺陷.选取B32脱精氨酸甘精胰岛素评价方法的专属性,证实本方法专属性良好;6次重复测定各肽段的保留时间及峰面积的RSD为0.05％～0.20％,考察不同实验人员在不同时间处理样品得到结果的变异程度,RSD为0.01％～0.36％,表明方法的中间精密度较好.V8酶量为15～25 U、柱温为38～42℃、采用3个不同厂家的色谱柱时测定的相对保留时间的RSD为0.12％～0.26％,表明方法的耐用性较好.酶解后的样品于6℃存放24 h及-20℃储存7d,稳定性较好.结论:实现了甘精胰岛素主成分的高效特异酶解及目标肽段的有效分离,该方法专属性、重复性、中间精密度及耐用性均表现良好,可用于甘精胰岛素的结构确证及专属性鉴别.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	张慧		9	1	1.0	1.0
2	梁成罡		27	7	2.0	2.0
4	李晶		8	5	2.0	2.0
5	张伟		5	3	1.0	1.0
6	王绿音		2	0	0.0	0.0
7	杨慧敏	中国药科大学生命科学与技术学院	1	0	0.0	0.0
8	李懿		2	0	0.0	0.0