TNF-α-shRNA对结核菌素诱导破骨细胞形成的影响

• 作者: 于洋 吴鹏 戈朝晖 梁思敏 殷飞 范凤龙 马荣 马赫
• 来源期刊: 中国脊柱脊髓杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 基因敲除技术 肿瘤坏死因子 结核菌素 破骨细胞
• 年，卷（期）: 2018,（8）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 741-747
• 页数: 7页
• 分类号: Q786
• 字数: 5656字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1004-406X.2018.08.11

摘要

目的:构建靶向肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)基因的短发卡RNA (short hairpin RNA,shRNA)表达载体,观察其对结核菌素(purified protein derivative,PPD)诱导破骨细胞形成的影响.方法:双酶切法构建TNF-α-shRNA,经脂质体转染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞),通过荧光显微镜观察TNF-α-shRNA的转染情况;采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)观察转染前及转染后第1、3、5、7天TNF-α基因的表达情况;以RAW264.7细胞为空白组、RAW264.7细胞+1IU· ml-1PPD为对照组、RAW264.7细胞+TNF-α-shRNA+1 IU· ml-1pPD为转染观察组、RAW264.7细胞+空载质粒+1 IU· ml-TPD为阴性转染组,采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)检测各组第3天TNF-α基因和蛋白的相对表达量;采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)计数各组第7天破骨细胞形成的数量.结果:TNF-α-shRNA经脂质体成功转染RAW264.7细胞,转染效率达70％～80％.RT-PCR显示转染后第3天TNF-α基因的表达最少,第5天次之,第1天、第7天和转染前比较差异不大.转染后第3天转染观察组TNF-α基因的相对表达量为0.46±0.03,同时间点空白组为1.00±0.00,对照组为1.43±0.09,阴性转染组为1.38±0.06.转染后第3天转染观察组TNF-α蛋白的相对表达量为55.34±0.82,同时间点空白组为59.13±1.43,对照组为82.72±1.84,阴性转染组为84.62±0.97.转染后第7天转染观察组破骨细胞形成的数量为19.33±1.53个,同时间点空白组为5.67±1.53个,对照组为56.67±3.79个,阴性转染组为59.67±3.51个.转染观察组的TNF-α基因和蛋白的相对表达量及破骨细胞数量与空白组、对照组、阴性转染组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);空白组与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);对照组与阴性转染组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:TNF-α-shRNA可以特异性地沉默RAW264.7细胞内TNF-α基因的表达,使TNF-α的产生减少,抑制PPD诱导的破骨细胞形成.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	戈朝晖	宁夏医科大学总医院骨科	41	166	7.0	11.0
2	殷飞		4	4	2.0	2.0
3	马荣	宁夏医科大学总医院骨科	37	76	4.0	6.0
4	于洋		9	23	3.0	4.0
5	梁思敏	宁夏医科大学总医院骨科	15	29	3.0	4.0
6	马赫		9	11	2.0	2.0
7	吴鹏		11	41	4.0	6.0
8	范凤龙		2	0	0.0	0.0