小菜蛾整合素integrin β1基因的克隆及其功能分析

• 作者: 仇培 余静 兰可可 张展滔 许小霞 郑锦龙 金丰良
• 来源期刊: 环境昆虫学报
• 学科: 农学
• 关键词: 小菜蛾 PxIntβ1 RT-PCR 原核表达 包囊作用
• 年，卷（期）: 2018,（4）
• 所属期刊栏目: 生理与生化
• 页码范围: 880-893
• 页数: 14页
• 分类号: Q963|S433.4
• 字数: 9501字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-0858.2018.04.20

摘要

整合素(Integrin)是一种由α和β亚基组成的跨膜异二聚体蛋白,在昆虫血细胞对外物的包囊过程中起着重要的作用.为阐明integrinβ1参与小菜蛾Plutella xylostella体内细胞免疫中的功能,本研究利用RT-PCR结合RACE技术克隆了小菜蛾integrinβ1基因的cDNA全长序列,命名为PxIntβ1(GenBank登录号GQ178290).小菜蛾PxIntβ1的cDNA全长序列为2 832 bp,开放阅读框为2 487 bp,编码828个氨基酸,成熟的氨基酸序列中有一个跨膜区和一个integrin亚基.系统进化树显示小菜蛾PxIntβ1与亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis整合素的同源性最高,两者同源性达到78％.利用半定量RT-PCR技术检测PxIntβ1基因在小菜蛾不同发育历期(卵、1-4龄幼虫、蛹、成虫)、不同组织(血细胞、体壁、脂肪体、中肠、马氏管)和细菌(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液)诱导下的表达模式.半定量结果表明小菜蛾PxIntβ1基因在小菜蛾整个发育历期除了卵之外都有表达,4龄幼虫转录水平最高,在血细胞中特异性的高表达,昆合细菌诱导2-48 h后,PxIntβ1基因在小菜蛾诱导后24 h达到诱导表达高峰.为了进一步获得重组蛋白PxIntβ1,本研究构建了原核表达质粒pET-32a-PxIntβ1,融合蛋白在大肠杆菌Eschericha coli BL21中获得高效表达,Ni-NTA一步纯化了融合蛋白,并免疫新西兰大白兔,获得了多克隆抗体anti-PxIntβ1.SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果表明,His抗体和多克隆抗体anti-PxIntβ1能特异性识别融合蛋白PxIntβ1;进一步利用显微镜观察了小菜蛾血细胞对凝胶珠Sephadex-A25的包囊情况,结果表明抗血清anti-PxIntβ1处理过的小菜蛾血细胞对Sephadex-A25凝胶珠的包囊作用受到明显抑制,重组蛋白Px Intβ1可以提高小菜蛾血细胞对Sephadex-A25凝胶珠的包囊作用;以上研究结果表明小菜蛾Pxlntβ1在小菜蛾细胞免疫中起着重要的作用.