黄色荧光蛋白的结构对Annexin A5凋亡检测功能的影响探究

• 作者: 华子春 张晶 王云轲 高梦月 黄先杰
• 来源期刊: 中国细胞生物学学报
• 关键词: 膜联蛋白A5 纯化 凋亡检测 流式细胞术 序列比对
• 年，卷（期）: 2018,（11）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 1894-1904
• 页数: 11页
• 语种: 中文
• DOI: 10.11844/cjcb.2018.11.0181

摘要

细胞凋亡早期,磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧,Annexin A5可与PS高亲和力结合,这是其检测凋亡的原理.绿色荧光探针标记的Annexin A5和碘化丙啶联合标记应用于流式细胞术进行细胞凋亡检测,该方法灵敏度高、特异性好、效率高,已成为目前全世界通用的细胞凋亡检测方法.除FITC-Annexin A5外,Annexin A5-EGFP融合蛋白是另一个常用的简单、可信、易于制备的凋亡检测探针.黄色荧光蛋白是绿色荧光蛋白的一种突变体,其荧光向红色光谱偏移.目前,有三种改良的黄色荧光蛋白:Citrine、Venus、Ypet,这三种改良的蛋白荧光更亮、更稳定、成熟更快.该文选择Citrine、Venus、Ypet来制备Annexin A5凋亡检测探针,通过原核表达和分离纯化Annexin A5-Citrine、AnnexinA5-Venus和Annexin A5-Ypet融合蛋白,获得了高产量的可溶性蛋白,探究这三种融合蛋白与凋亡细胞的结合能力,筛选出适用于流式检测的黄色荧光蛋白标记的Annexin A5,为后续研究奠定基础.以pET28a-Annexin A5-EGFP-his重组质粒为模板,利用分子生物学手段又构建了重组质粒pET28a-Annexin A5-Citrine-his、pET28a-Annexin A5-Venus-his、pET28a-Annexin A5-Ypet-his,然后通过Ni柱亲和层析纯化获得了这三种蛋白,纯度约为90％.该文重点比较了三者检测细胞凋亡的能力,流式细胞仪检测结果显示,Annexin A5-Citrine、Annexin A5-Venus和Annexin A5-Ypet融合蛋白均可以识别和标记凋亡细胞,它们与凋亡细胞的亲和力分别是3 113.0 nmol/L、444.3 nmol/L和391.6 nmol/L.三者与凋亡细胞的亲和力差异很大,通过对Citrine、Venus、Ypet的氨基酸序列进行分析,该文初步发现了决定三个黄色荧光蛋白与凋亡细胞亲和力的关键氨基酸.