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摘要:
[目的]通过体外建立安淮山羊胎儿肌肉干细胞分离培养及成肌诱导分化的方法,为进一步研究调控山羊肌肉干细胞增殖与分化的分子机制提供实验材料.[方法]本试验选取山羊胎儿背最长肌肌肉组织,用眼科剪剪成肉糜后,用0.1%的I型胶原酶消化40 min,然后利用0.25%的胰酶消化15 min.分离得到的细胞用生长培养基(20%FBS+80%DMEM/F12+青链霉素)培养于37℃、5%CO2培养箱内.培养2h后采用差速贴壁技术对细胞进行纯化,又2h后,重复纯化一次.待细胞生长至70%左右密度时可进行传代培养.每次传代培养均采用差速贴壁30min的方法进一步纯化肌肉干细胞,共纯化至第6代.利用免疫荧光技术检测第6代细胞中肌肉干细胞标记基因Pax7、MyoD1的蛋白表达情况,从而对分离得到的细胞进行鉴定.当肌肉干细胞生长至70%左右密度时,将生长培养基更换为分化培养基(2%FBS+98%DMEM/F12+青链霉素),诱导细胞向成肌方向分化并观察细胞的形态学变化.细胞诱导分化1d后,采用免疫荧光技术检测肌肉干细胞的分化标记基因Myog的蛋白表达情况.另外,分别提取诱导0、1、3、5、7d后的细胞的总RNA,通过反转录试剂盒反转成cDNA后,利用qPCR测定MyoD1和Myog的相对表达量.[结果]分离得到的细胞呈贴壁生长,其形态趋于稳定后主要呈长梭形或纺锤形.免疫荧光技术检测的第6代细胞中Pax7和MyoD1蛋白均为阳性表达.采用分化培养基诱导细胞分化后,在显微镜下可观察到随着诱导天数的增加,细胞开始分化、相互融合成肌管且具有一定的方向性.免疫荧光检测结果表明Myog蛋白呈明显的阳性表达.另外,qPCR结果显示,标志基因MyoD1和Myog均有表达,且MyoD1的相对表达量在分化的第1天相比于0天显著升高并维持到第3天,第5、7天开始显著下降但仍显著高于增殖期.Myog在分化不同天数的细胞中的相对表达量具有类似的趋向.[结论]分离得到了纯度较高的安淮山羊胎儿肌肉干细胞,且诱导后展现出较好的成肌潜力.研究结果可为进一步开展肌肉干细胞成肌分化的分子机制研究提供材料来源.
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文献信息
篇名 山羊胎儿肌肉干细胞的分离培养与成肌诱导分化
来源期刊 中国农业科学 学科
关键词 山羊胎儿 肌肉干细胞 分离培养 鉴定 成肌分化
年,卷(期) 2018,(8) 所属期刊栏目 畜牧·兽医·资源昆虫
研究方向 页码范围 1590-1597
页数 8页 分类号
字数 4943字 语种 中文
DOI 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.016
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研究主题发展历程
节点文献
山羊胎儿
肌肉干细胞
分离培养
鉴定
成肌分化
研究起点
研究来源
研究分支
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引文网络交叉学科
相关学者/机构
期刊影响力
中国农业科学
半月刊
0578-1752
11-1328/S
大16开
北京中关村南大街12号
2-138
1960
chi
出版文献量(篇)
9193
总下载数(次)
12
相关基金
安徽省自然科学基金
英文译名:Anhui Provincial Natural Science Foundation
官方网址:http://www.ahinfo.gov.cn/zrkxjj/index.htm
项目类型:安徽省优秀青年科技基金
学科类型:
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