应用合成生物学策略构建全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻

• 作者: 李检秀 莫棋文 谢能中 陈先锐 陈小玲 黄日波 黄艳燕
• 来源期刊: 中国生物工程杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 全细胞生物催化剂 辅酶再生系统 丁二酮还原酶 乙偶姻
• 年，卷（期）: 2019,（4）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 60-68
• 页数: 9页
• 分类号: Q819
• 语种: 中文
• DOI: 10.13523/j.cb.20190408

摘要

目的:在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶(DAR), 同时构建辅酶NADH原位再生系统, 利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻.方法:PCR克隆多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) dar基因连到质粒pETDuet-1, 转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3), 构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR;通过Hi Trap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白, 测定DAR的比酶活和分子动力学参数.在重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统, 协同表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 的葡萄糖脱氢酶(GDH), 构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH, 并以此重组菌为全细胞生物催化剂, 优化催化条件, 提高(S)-乙偶姻的产量和产率.结果:获得重组工程菌E. coli BL21(DE3)-DAR和E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH.DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2. 59mmol/L、1. 64μmol/(L·min·mg) 、12. 3/s, 还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95. 86％, 具有较好的催化效率和立体异构体选择性.构建辅酶NADH原位再生系统后, 重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻.在最优催化条件下分批补料, 乙偶姻产量达51. 26g/L, 转化率为81. 37％, 生产速率为5. 13g/(L·h) .结论:使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻, 以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻, 不需额外添加昂贵的辅酶, 具有较高的生产应用价值.