三种诱导因子在骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞分化中的作用

• 作者: 王远航 薛斌
• 来源期刊: 中华烧伤杂志
• 关键词: 间充质干细胞 血管内皮生长因子C 肝细胞生长因子 细胞分化 碱性成纤维细胞生长因子 淋巴管内皮细胞
• 年，卷（期）: 2019,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 125-133
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2019.02.008

摘要

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子C(VEGF-C)在骨髓间充质干细胞(BMSC)向淋巴管内皮细胞(LEC)分化中的作用. 方法 取第3～5代大鼠BMSC进行实验.(1)取大鼠BMSC,采用随机数字表法(分组方法下同)分为阴性对照组、CD90组、CD44组、CD34组,每组样本数为3,阴性对照组细胞加入磷酸盐缓冲液5μL,余3组细胞分别加入相应抗体5 μL,流式细胞仪检测细胞表面抗原阳性情况.(2)取3个批次大鼠BMSC,均分为空白对照组、VEGF-C组、HGF组、bFGF组、VEGF-C+HGF组、VEGF-C+bFGF组、HGF+bFGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组,每组样本数为3.空白对照组细胞加入2 mL完全培养基,VEGF-C组细胞中加入2 mL完全培养基和10 μg/mL VEGF-C 10 μL,HGF组细胞加入2 mL完全培养基和10 μg/mL HGF 16 μL,bFGF组细胞加入2 mL完全培养基和1μg/mL bFGF 20 μL,VEGF-C+ HGF组、VEGF-C +bFGF组、HGF+ bFGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞加入2 mL完全培养基及同前相应浓度和量的诱导因子.培养10d,倒置相差显微镜下观察细胞形态,蛋白质印迹法和实时荧光定量反转录PCR法分别检测淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE-1)、VEGF受体3(VEGFR3)及整合素α9蛋白和mRNA表达.(3)取大鼠BMSC,分为空白对照组、HGF+ VEGF-C+ bFGF组、bFGF+ VEGF-C+HGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组,每组样本数为3.空白对照组细胞加入2 mL完全培养基;HGF+VEGF-C +bFGF组细胞加入2 mL完全培养基、10 μg/mL HGF 16 μL、10 μg/mL VEGF-C 10μL,6h后加入1 μg/mL bFGF 20 μL.bFGF+VEGF-C+HGF组细胞加入2 mL完全培养基以及1μg/mLbFGF 20 μL和10 μg/mL VEGF-C 10 μL,6h后加入10 μg/mL HGF 16 μL;VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞同时加入2 mL完全培养基及同前浓度及量的3种诱导因子.另取2个批次大鼠BMSC,同前进行分组,除将HGF+ VEGF-C+ bFGF组、bFGF+ VEGF-C+ HGF组6h的间隔时间调整为12、24 h外,其余处理方法同前.培养10 d,蛋白质印迹法检测LYVE-1、VEGFR3及整合素α9的蛋白表达.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正. 结果 (1)阴性对照组、CD90组、CD44组、CD34组细胞表面抗原阳性表达率分别为0.39％、99.84％、99.90％、0.57％.(2)培养10 d,空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF+ bFGF组细胞呈长梭形,其余各组细胞呈多边形.(3)培养10d,空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF+ bFGF组细胞无LYVE-1、VEGFR3和整合素α9蛋白表达.培养10 d,VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞LYVE-1、VEGFR3和整合素α9的蛋白表达量均明显高于VEGF-C组(t=24.21、11.04、15.43,P＜0.01)、VEGF-C+ HGF组(t=10.81、9.93、10.20,P ＜0.01)、VEGF-C+ bFGF组(t=11.67、6.32、19.00,P＜0.01). VEGF-C +HGF组及VEGF-C+bFGF组细胞LYVE-1的蛋白表达量明显高于VEGF-C组(t=8.69、15.20,P＜0.01);VEGF-C+bFGF组细胞VEGFR3的蛋白表达量明显高于VEGF-C组及VEGF-C+HGF组(t=8.67、7.21,P＜0.01);VEGF-C+ HGF组细胞整合素α9的蛋白表达量明显高于VEGF-C组及VEGF-C+ bFGF组(t=8.80、8.83,P＜0.01).(4)培养10d,空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF+ bFGF组细胞均无LYVE-1、VEGFR3和整合素α9 mRNA表达.培养10d,VEGF-C组细胞LYVE-1、VEGFR3的mRNA表达量明显低于VEGF-C+ bFGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组(tLYVE-1=6.22、18.01,tVEGFR3=8.49、15.34,P＜0.01),整合素α9的mRNA表达量明显低于VEGF-C+ HGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组(t=13.24、9.65,P＜0.01).VEGF-C+HGF+bFGF组细胞LYVE-1、VEGFR3和整合素α9的mRNA表达量明显高于VEGF-C+ HGF组、VEGF-C+ bFGF组(t =13.92、11.95,13.72、5.27,5.64、9.10,P＜0.01).VEGF-C+ HGF组细胞VEGFR3 mRNA表达量明显低于VEGF-C+ bFGF组(t=6.91,P＜0.01),整合素α9 mRNA表达量明显高于VEGF-C+ bFGF组(f=11.69,P＜0.01).(5)间隔6、12、24 h培养10d,空白对照组细胞均无LYVE-1、VEGFR3及整合素α9蛋白表达.间隔6、12、24 h培养10 d,HGF+ VEGF-C+ bFGF组、bFGF+ VEGF-C+ HGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞LYVE-1、VEGFR3及整合素α9蛋白表达量相近(F6h=2.25、2.47、2.19,F12 h=2.93、1.47、3.25,F24h =0.28、0.20、1.01,P＞0.05). 结论 VEGF-C是诱导BMSC向LEC分化必需的因子,HGF和bFGF可能分别是通过上调整合素α9和VEGFR3的表达来促进分化的,但二者的诱导作用可能是各自独立的.3种诱导因子联合作用诱导分化效果最佳.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	薛斌	重庆医科大学附属第一医院烧伤整形外科	31	276	8.0	16.0
2	王远航	重庆医科大学附属第一医院烧伤整形外科	1	2	1.0	1.0