PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究

• 作者: 刘晓贺 巴根 张爽 明胜利 李坚 杜永坤 杨国宇 王江 褚贝贝 韩莹倩
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: CRISPR/Cas9 TANK结合激酶1 基因敲除 猪伪狂犬病病毒
• 年，卷（期）: 2019,（6）
• 所属期刊栏目: 预防兽医
• 页码范围: 1239-1248
• 页数: 10页
• 分类号: S852.659.1
• 字数: 6021字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.06.014

摘要

TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用.为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响.然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Western blot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响.结果 显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK 1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响.流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89％,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95％,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制.RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRV mRNA转录和蛋白表达.滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为106.8 TCID50·0.1 mL-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为108.5 TCID50·0.1 mL-1.另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调.以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关.