两种构象呼吸道合胞病毒F蛋白的表达、活性检测及构象分析

• 作者: 李雄雄 王健 唐悦 王剑 吴元元 王云瑾 陈玥如 赵忆宁 王婉 傅生芳 马超
• 来源期刊: 微生物学免疫学进展
• 关键词: 呼吸道合胞病毒F蛋白 融合前构象 融合后构象 三聚体
• 年，卷（期）: 2020,（6）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 8-15
• 页数: 8页
• 分类号: R373.1+4
• 语种: 中文
• DOI: 10.13309/j.cnki.pmi.2020.06.002

摘要

目的 分析呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F蛋白融合前、融合后构象及其三聚体;比较不同细胞表达的融合前RSV F蛋白(Pre-F)的活性.方法 分别构建和制备含有Pre-F和融合后RSV F蛋白(Post-F)基因的重组质粒,转染Xten293或者XtenCHO细胞后,收获上清进行蛋白纯化.然后,利用融合前特异性抗体D25和AM14通过Western blotting和ELISA对纯化后的RSV F蛋白进行融合前、融合后构象验证和聚体分析,并对不同细胞表达的Pre-F与抗体的结合活性进行比较.结果 成功构建并转染了含有Pre-F和Post-F基因的重组质粒;收获后的上清经His标签纯化获得了纯度较高的目的蛋白;经SDS-PAGE分析显示,在变性还原条件下,RSV F蛋白裂解为F2和F1两个蛋白.Western blotting和ELISA检测结果显示,只有Pre-F可以与D25抗体发生特异性反应,而Post-F与D25抗体不发生特异性反应.Pre-F和Post-F聚体构象分析表明,在变性非还原条件下,RSV F蛋白主要以单体的形式存在;Native-PAGE检测结果证实,两种构象的RSV F蛋白均以三聚体的形式存在;Western blotting和ELISA检测结果显示,只有Pre-F三聚体能与AM14抗体特异性结合.此外,不同细胞表达的Pre-F与D25和AM14抗体的结合活性不同,其中Xten293细胞表达的Pre-F与D25和AM14抗体的结合活性更高.结论 成功分析了Pre-F和Post-F的构象,并对两种构象的RSV F蛋白三聚体活性进行了验证和比较,这些将为今后RSV F蛋白亚单位疫苗研发中质量控制方法的建立提供数据参考.