2型猪链球菌二元信号系统孤儿调控因子CovR磷酸化位点鉴定

• 作者: 王悄悄 李超龙 张会芳 刘旭苗 郑峰 汪春晖 潘秀珍 曹祥荣
• 来源期刊: 中国人兽共患病学报
• 关键词: 2型猪链球菌 丝氨酸/苏氨酸激酶 孤儿调控因子CovR 磷酸化检测
• 年，卷（期）: 2021,（5）
• 所属期刊栏目: 论著|Original Articles
• 页码范围: 392-397
• 页数: 6页
• 分类号: R378.1+2
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.054

摘要

目的 利用E scherichia coli BL21原核表达系统共表达2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶STK与孤儿调控因子CovR蛋白,通过质谱鉴定CovR蛋白磷酸化位点,探究STK对CovR的磷酸化作用.方法 构建CovR蛋白表达载体pCDF-Duet-1::covR及pCDFDuet-1::covR/stk,重组表达蛋白分别命名为CovR1与CovR2.通过蛋白磷酸化质谱技术检验CovR2蛋白的关键磷酸化位点.分别构建CovR苏氨酸突变体CovRT、丝氨酸突变体CovRS、酪氨酸突变体CovRY及丝/苏/酪氨酸全突变体CovRA,与STK共表达后分析其磷酸化状态,确定CovR磷酸化靶点.结果 在E.coli BL21表达系统中成功表达并纯化CovR1与CovR2蛋白,Western blot分析发现CovR1无磷酸化信号,CovR2可以被磷酸化.进一步对CovR2磷酸化质谱检测发现其第45、148、150、159、168、194、219位苏氨酸,第40、172、215位丝氨酸以及第225位酪氨酸为关键磷酸化位点.对CovRT、CovRS、CovRY及CovRA突变体磷酸化状态检测,结果表明CovR2的丝/苏/酪氨酸均可发生磷酸化.结论 在E.coli BL21中共表达STK与CovR可导致CovR丝/苏/酪氨酸磷酸化,通过质谱技术鉴定了CovR的磷酸化位点,提示CovR可能是STK的磷酸化调控靶点.