轮状病毒NSP5克隆、鉴定、表达及其条件优化

• 作者: 林家锋 陶晓莉 陆恒章 于美玲 李婷婷 李藤菲 程美慧 李永刚
• 来源期刊: 中国人兽共患病学报
• 关键词: 轮状病毒 NSP5 基因重组 蛋白表达 蛋白纯化
• 年，卷（期）: 2021,（8）
• 所属期刊栏目: 实验研究|Experimental Studies
• 页码范围: 703-708
• 页数: 6页
• 分类号: R373.2
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.092

摘要

目的 为制备NSP5多克隆抗体及进一步研究NSP5的功能和在轮状病毒复制中的作用奠定基础.方法 利用分子克隆的技术构建出原核表达蛋白质粒NSP5-pGEX-6P-1和真核表达质粒NSP5-pFLAG--CMV-3,其中NSP5-pFLAG-CMV-3转染细胞后通过Western Blot和间接免疫荧光法观测NSP5在293T细胞里的表达和定位;NSP5-pGEX-6P-1经转化E.coli BL21(DE3)后从IPTG浓度、温度及历经时间3个方面摸索出最优化的诱导蛋白表达条件,并经GST琼脂糖树脂纯化蛋白且用SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定.结果 构建了真核表达载体NSP5-pFLAG-CMV-3和原核表达载体NSP5-pGEX-6P-1.经NSP5-pFLAG-CMV-3转染后的293T细胞通过Western Blot验证NSP5蛋白在细胞中成功表达,间接免疫荧光观察到重组蛋白在细胞质中富集.37℃、8h、0.4 mmol/L IPTG诱导是NSP5-pGEX-6P-1蛋白表达的最适条件,且以包涵体形式汇聚在沉淀中进行表达.SDS-PAGE和Western Blot表明重组蛋白纯化成功.结论 成功构建NSP5重组表达系统,成功优化了NSP5蛋白诱导表达的条件并纯化蛋白.