沉默非肌肉肌球蛋白Ⅱ骨髓间充质干细胞移植对内毒素/脂多糖诱导急性肺损伤大鼠肺细胞外基质的影响

• 作者: 尹希 周万芳 侯文佳 范明枝 伍国胜 刘晓彬 马琪敏 王玉松 朱峰
• 来源期刊: 中华烧伤与创面修复杂志
• 关键词: 急性肺损伤 间充质干细胞 细胞外基质 基因沉默 非肌肉肌球蛋白Ⅱ
• 年，卷（期）: 2022,（5）
• 所属期刊栏目: 论著·烧伤合并症及脏器功能损害
• 页码范围: 422-433
• 页数: 12页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220212-00024

摘要

目的:探讨沉默非肌肉肌球蛋白Ⅱ（ NMⅡ）基因的骨髓间充质干细胞（BMMSC）对内毒素/脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）大鼠肺细胞外基质（ECM）和肺纤维化的影响。 方法:采用实验研究方法。取4只1周龄雄性SD大鼠股骨和胫骨骨髓腔细胞并经流式细胞术鉴定为BMMSC。取第3代BMMSC用于后续实验。取细胞，分为用含 NMⅡ基因的小干扰RNA序列的pHBLV-U6-ZsGreen-Puro质粒转染的沉默NMⅡ组，转染空载质粒的空载组及未进行任何处理的空白对照组，采用蛋白质印迹法检测干预后72 h的NMⅡ的蛋白表达（样本数为3）。取细胞，于倒置相差显微镜下观察形态；另取细胞，用氯甲基苯甲酰胺（CM-DiⅠ）标记，于倒置荧光显微镜下观察体外细胞标记情况。取20只4周龄雄性SD大鼠，按随机数字表法分为空白对照组、单纯ALI组、ALI+BMMSC组及ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组，每组5只大鼠。对空白对照组不进行任何处理，其余3组大鼠均给予LPS诱导ALI。造模后即刻，单纯ALI组大鼠经尾静脉注射1 mL生理盐水，ALI+BMMSC组、ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠分别经尾静脉注入1 mL 1×10 7个/mL CM-DiⅠ标记的BMMSC、 NMⅡ基因沉默的BMMSC，空白对照组大鼠于相同时间点通过尾静脉注射1 mL生理盐水。干预后24 h，取肺组织于倒置荧光显微镜下观察BMMSC肺内归巢情况。干预后24 h、1周、2周，取肺组织行苏木精-伊红染色观察肺部炎症情况，行Masson染色观察肺纤维化程度并采用改良Ashcroft评分法对干预后2周肺纤维化程度进行评分（样本数为5）。采用免疫组织化学法检测干预后2周α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9的含量（样本数均为3），采用酶联免疫吸附测定法检测干预后24 h超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛、髓过氧化物酶（MPO）活性（样本数均为3），采用免疫荧光染色法检测干预后1周CD11b和含表皮生长因子样模块黏蛋白样激素受体1（EMR1）蛋白表达（样本数均为3）。对数据行单因素方差分析、Bonferroni法及Kruskal-Wallis H检验。 结果:干预后72 h，沉默NMⅡ组细胞NMⅡ蛋白表达水平显著低于空白对照组和空载组（ P值均<0.01）。BMMSC呈长梭形，簇状生长形如旋涡；CM-DiⅠ体外成功标记BMMSC。干预后24 h，ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺内细胞归巢现象较ALI+BMMSC组更明显，而空白对照组和单纯ALI组大鼠肺内未见CM-DiⅠ标记的细胞。空白对照组大鼠干预后各时间点肺组织中均未见明显炎症细胞浸润，ALI+BMMSC组和ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠干预后24 h肺组织炎症细胞浸润较单纯ALI组明显减少，且2组大鼠干预后1、2周肺泡壁变薄，局部肺组织有少量淤血。干预后1、2周，单纯ALI组、ALI+BMMSC组和ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺组织胶原纤维沉积均较空白对照组明显加重，但ALI+BMMSC组和ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺组织胶原纤维沉积均较单纯ALI组显著改善。干预后2周，单纯ALI组、ALI+BMMSC组和ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺纤维化改良Ashcroft评分分别为（2.36±0.22）、（1.62±0.16）、（1.06±0.26）分，均明显高于空白对照组的（0.30±0.21）分（ P<0.01），ALI+BMMSC组和ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺纤维化改良Ashcroft评分均明显低于单纯ALI组（ P<0.01），ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺纤维化改良Ashcroft评分明显低于ALI+BMMSC组（ P<0.01）。干预后2周，与单纯ALI组比较，ALI+BMMSC组、ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺组织α-SMA含量均显著下降（ P<0.05或 P<0.01）。4组大鼠肺组织MMP-2含量均相近（ P>0.05）。与空白对照组比较，单纯ALI组大鼠肺组织MMP-9含量显著升高（ P<0.01）；与单纯ALI组比较，ALI+BMMSC组、ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺组织MMP-9含量均显著降低（ P<0.01）。干预后24 h，与空白对照组比较，单纯ALI组、ALI+BMMSC组、ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺组织丙二醛、SOD、MPO活性均显著升高（ P<0.01）；与单纯ALI组比较，ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺组织丙二醛活性显著升高（ P<0.05），ALI+BMMSC组、ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺组织SOD活性均显著升高（ P<0.01）；与ALI+BMMSC组比较，ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺组织SOD活性显著降低（ P<0.01）。与单纯ALI组比较，ALI+BMMSC组、ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺组织MPO活性均显著降低（ P<0.01）；与ALI+BMMSC组比较，ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺组织MPO活性显著降低（ P<0.01）。干预后1周，与其他3组比较，ALI+沉默NMⅡ的BMMSC组大鼠肺组织CD11b蛋白表达显著增加（ P<0.05或 P<0.01）；4组大鼠肺组织EMR1蛋白表达均相近（ P>0.05）。 结论:移植沉默 NMⅡ基因的BMMSC能更明显改善LPS所致ALI大鼠肺组织ECM成分的活性，重塑其完整性，增强其抗氧化能力，减轻肺损伤和肺纤维化。