鸡Toll样受体15单克隆抗体的制备及其初步应用

• 作者: 李梦妮 王航 傅思瑶 杨梓纯 许炎辉 樊毛迪 高崧 刘秀梵
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: ChTLR15 单克隆抗体 抗原表位 免疫组化 细胞定位
• 年，卷（期）: 2022,（2）
• 所属期刊栏目: 基础兽医|BASIC VETERINARY MEDICINE
• 页码范围: 576-587
• 页数: 12页
• 分类号: S852.4
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2022.02.024

摘要

旨在制备鸡Toll样受体15 (ChTLR15)的特异性单克隆抗体(mAb),并初步应用.利用PCR技术扩增ChTLR15第162-386位氨基酸,克隆于载体pET-30a中进行诱导表达,获得高纯度的重组ChTLR15 (162-386 aa)蛋白.然后采用皮下多点注射方式将ChTLR15免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,常规获得针对ChTLR15蛋白的单克隆抗体.运用原核表达系统对ChTLR15基因进行截短表达,对单克隆抗体针对的ChTLR15抗原表位进行鉴定.利用6C7株单克隆抗体以激光共聚焦显微技术对鸡HD11细胞进行定位,同时,利用免疫组化技术确定ChTLR15在鸡部分组织中的分布情况.结果 表明:成功构建重组质粒pET-30a-ChTLR15(162-386 aa),经IPTG诱导表达后,获得以包涵体形式存在的约26 ku的重组蛋白ChTLR15(162-386 aa).方阵试验表明,最适血清稀释度为1∶6400,最适抗原包被浓度为0.35 μg·mL-1.采用有限稀释法进行4轮筛选,最终获得4株针对ChTLR15蛋白的单克隆抗体,将其以2G4、6C7、6D10、7C4进行命名.2G4与6C7的亚类为IgG2a,6D10与7C4的亚类为IgG1.Western blot结果显示,4株单抗均能与ChTLR15发生特异性反应,而不与其他受检蛋白反应.运用原核表达系统对ChTLR15 (162-386 aa)进行截短表达,对ChTLR15单克隆抗体的抗原表位进行鉴定.结果 显示,单抗2G4与7C4识别的抗原表位为230 QLGTVLEF237,6C7与6D10识别的抗原表位为245 EMDLLS250.细胞定位结果显示,ChTLR15蛋白位于细胞表面.免疫组化结果显示,健康对照鸡肝、脾、肺、肾均有微弱阳性染色,禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)感染鸡肝、脾、肺、肾阳性染色有所增强.本研究通过淋巴细胞杂交瘤技术成功获得4株抗ChTLR15蛋白的单克隆抗体,通过截短免疫原蛋白法对其识别的线性表位进行鉴定,可用于进一步研究ChTLR15的结构与功能,为后续信号通路、免疫机理、疫苗研发等相关领域的研究提供了有力工具.