应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP5的上调基因

• 作者: 党晓燕 张健 成军 王建军 王春花 纪冬 邓红
• 来源期刊: 胃肠病学和肝病学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 丙型肝炎病毒 NS5A蛋白 消减杂交
• 年，卷（期）: 2004,（1）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 35-38
• 页数: 4页
• 分类号: R512.63
• 字数: 3467字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1006-5709.2004.01.010

摘要

目的通过抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A反式激活蛋白5(NS5ATP5)的反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,筛选HCVNS5ATP5蛋白反式激活靶基因.方法以HCV NS5ATP5表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果成功构建人HCVNS5ATP5蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到91个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中86个均得到100～1 000 bp插入片段.挑取32个插入片段测序分析.其中包括结缔组织生长因子、纤维连接蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白l等重要的基因.结论成功筛选出HCV NS5ATP5的上调基因.