携带人胰岛素样生长因子-1重组腺病毒的构建和鉴定

• 作者: 刘尚礼 崔力扬 沈慧勇 郑召民 黄东生 黄宗强
• 来源期刊: 中山大学学报(医学科学版)
• 学科: 生物学
• 关键词: 腺病毒 胰岛素样生长因子 克隆,分子
• 年，卷（期）: 2004,（1）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 45-51
• 页数: 7页
• 分类号: Q132.1+4
• 字数: 5310字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1672-3554.2004.01.010

摘要

[目的] 采用 Cre-LoxP同源重组系统构建并鉴定携带人胰岛素样生长因子-1( human insulin-like growth factor-1, hIGF-1)目的基因的复制缺陷重组腺病毒,为椎间盘退变的 hIGF-1基因治疗奠定基础.[方法] PCR合成 hIGF-1基因,用 pMD18-T载体克隆 hIGF-1目的基因,酶切、测序并进行 NCBI BLAST相似性在线分析.将 pMD18-T-hIGF-1和 pDNR-1r质粒分别行 EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切, DNA 连接酶连接双酶切产物,转化感受态大肠杆菌 DH5α,合成中间载体 pDNR-hIGF-1,酶切鉴定.Cre-loxP系统介导 pDNR-hIGF-1和 pInt.AV1.SpaT同源重组形成 pInt.AV1.SpaT-hIGF-1重组表达质粒,行 EcoRⅠ酶切鉴定.复苏 293细胞,将 pInt.AV1.SpaT-hIGF-1和 pInt.B.B质粒在 293细胞内进行同源重组成含 hIGF-1基因的复制缺陷重组腺病毒.倒置显微镜观察 293细胞病变样效应( cytopathogenic effect, CPE);透射电镜观察 293细胞中的病毒颗粒;提取细胞裂解液中病毒 DNA, PCR鉴定 hIGF-1目的基因的存在; Western blot 检测 hIGF-1蛋白表达.用半数组织培养感染量 (tissue culture infectious dose 50,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度.[结果]克隆的 hIGF-1目的基因经 NCBI BLAST相似性在线分析证实与 Homo sapiens IGF-1 (GI:19923111)完全相同.pInt.AV1.SpaT-hIGF-1酶切鉴定,出现 5.4 kb和 1 kb两条片段,与理论值完全相符.转染 293细胞 12～ 14 d后,大部分细胞出现肿胀,脱落等细胞病变样效应.PCR鉴定细胞裂解液中含有 hIGF-1目的基因.Western blot 证实重组腺病毒表达 hIGF-1蛋白.第 2代腺病毒的滴度为 80× 106 PFU/mL.[结论]成功构建出含有 hIGF-1目的基因的复制缺陷重组腺病毒.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘尚礼	中山大学附属第二医院骨科	207	1649	19.0	31.0
2	黄东生	中山大学附属第二医院骨科	128	832	15.0	21.0
3	沈慧勇	中山大学附属第二医院骨科	99	805	14.0	21.0
4	郑召民	中山大学附属第二医院骨科	138	1705	22.0	35.0
5	黄宗强	中山大学附属第二医院骨科	5	52	3.0	5.0
6	崔力扬	中山大学附属第二医院骨科	5	34	3.0	5.0