糖尿病的基因治疗技术:大鼠胰岛素原基因真核细胞表达质粒构建与鉴定

• 作者: 刘翠萍 刘超 吴海玮 唐伟 季旻珺 张兆松 蒋琳 贾悦
• 来源期刊: 中国临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 胰岛素/遗传学 胰岛素原 基因疗法 重组,遗传
• 年，卷（期）: 2004,（27）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 5844-5846
• 页数: 3页
• 分类号: R587.1
• 字数: 5310字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2004.27.049

摘要

目的:构建大鼠胰岛素原基因的真核细胞表达质粒 pCMV/proinsulin并进行序列测定.方法:实验选用雄性 SD大鼠 1只,从大鼠胰腺组织中提取总 RNA,通过 RT-PCR法获得胰岛素原基因 cDNA全长序列,并采用现代分子生物学技术,借助真核细胞表达质粒 pCMV-Script vector具有多克隆酶切位点的特点,选择适当的限制性酶切位点( EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ),并使大鼠胰岛素原基因 cDNA两端带有相同的酶切位点,利用其黏性末端进行定向克隆,从而将大鼠胰岛素原基因准确地插入到表达质粒 pCMV上.结果:经 RT-PCR法扩增并通过 DNA核酸序列测定获得大鼠胰岛素原基因.经 PCR法及酶切法初步筛选阳性克隆重组子,并进一步进行 DNA核酸序列测定(双脱氧末端终止法),确定其序列与目的基因序列完全一致.结论:成功构建重组质粒 pCMV/proinsulin,为进一步进行胰岛素原基因转染糖尿病大鼠和非胰岛β细胞,使之产生胰岛素、建立类胰岛β细胞系的研究奠定了扎实的基础.