抑制VEGF表达的锤头状核酶系统

• 作者: 张红宇 戴信兰 朱景德 李晶 杨剑峰 费琦 高宝梅
• 来源期刊: 中国肿瘤生物治疗杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 血管内皮生长因子 锤头状核酶 试管内和细胞内核酶剪切实验 抗血管生成
• 年，卷（期）: 2005,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 167-173
• 页数: 7页
• 分类号: R730
• 字数: 4322字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2005.03.002

摘要

目的:建立和评估抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达的锤头状核酶(hammerhead ribozyme)技术系统.方法:对VEGF121基因RNA序列进行二级结构分析,选择靶点;设计并构建针对VEGF的分泌肽RNA的可表达锤头状核酶(14)载体系统和VEGF-荧光色素酶融合基因报告质粒;通过试管内切割实验等方法评估核酶对于试管内转录得到的VEGF RNA切割特异性和效率;通过瞬时共转染实验和稳定转染实验评估核酶在细胞内对于VEGF RNA的切割效率.结果:设计和构建了对VEGF RNA二级结构水平上的暴露区(+8,+36和+71位点:核酶1,3和4)和非暴露区(+17位点:核酶2)4个锤头状核酶(14)的两套质粒;试管内切割检测表明,针对+8,+36和+71位点的核酶(1,3和4)可以有效地在试管内对VEGFRNA进行特异性切割,使其水平分别降至对照的61.7%,27.6%和44.8%(荧光色素酶活性)或66.3%,27.0%和30.0%(蛋白质水平);将核酶表达质粒与VEGF-LUC模板质粒瞬时共转染人SMMC-7721肝癌细胞,核酶1,3和4 VEGF-LUC水平分别降低到对照的81.4%,56.6%和69.1%;稳定表达针对VEGF的核酶1,3或4的SMMC-7721细胞株中,内源性VEGF RNA的水平降至对照水平的5%以下.对照未转染的、转染空载体的和转染了核酶2(+17)的SMMC-7721细胞.结论:分别针对VEGF+8,+36和+71位点锤头状核酶可有效地抑制VEGF的RNA水平.