人组织型纤溶酶原激活剂-水蛭素融合基因的构建及其在毕赤酵母中的表达

• 作者: 于爱平 吴祖泽 石炳兴 董春娜 蒋中华
• 来源期刊: 生物工程学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 融合蛋白 人组织型纤溶酶原激活剂 水蛭素 溶栓 抗凝
• 年，卷（期）: 2005,（4）
• 所属期刊栏目: 基因工程
• 页码范围: 553-557
• 页数: 5页
• 分类号: Q786
• 字数: 4496字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-3061.2005.04.009

摘要

构建并表达兼有溶栓和抗凝活性、减少出血副作用的人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和水蛭素(HV2)的融合蛋白.通过提取总RNA和RT-PCR获得t-PA基因,与HV2基因通过活化凝血因子X(FXa)识别序列(IEGR)的对应碱基序列连接构成融合蛋白基因,融合蛋白基因经pGEM-T、pIC9克隆至表达载体pIC9K上,电转导入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115.转化子摇瓶内甲醇诱导表达.纤维蛋白平板溶圈法和纤维蛋白凝块法分别检测溶栓和抗凝活性.琼脂糖凝胶电泳结果显示克隆的t-PA基因片段大小为1700bp,序列测定结果表明其35位氨基酸由文献报道的精氨酸突变为色氨酸.限制性酶切和PCR鉴定结果均表明融合蛋白基因已克隆入表达载体和宿主菌.甲醇利用实验、G418抗性筛选获得多拷贝甲醇利用快型克隆.甲醇诱导表达产物具有纤溶活性并可被抗t-PA抗体抑制.完整融合蛋白无抗凝活性,但以FXa裂解后可释放抗凝活性.同时,融合蛋白以单链和双链两种形式存在.融合蛋白在血栓部位特有的FXa作用下靶向释放抗凝活性,具有溶栓抗凝双功能,有望降低临床出血副作用.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	石炳兴	军事医学科学院放射医学研究所	4	23	3.0	4.0
2	吴祖泽	军事医学科学院放射医学研究所	153	1469	18.0	31.0
3	于爱平	军事医学科学院放射医学研究所	15	93	5.0	9.0
4	董春娜	军事医学科学院放射医学研究所	7	40	4.0	6.0
5	蒋中华	军事医学科学院放射医学研究所	15	129	5.0	11.0