平滑肌细胞纯化载体构建及在小鼠胚胎干细胞中的表达

• 作者: 吴光哲 康建 田孝祥 闫承慧 陶杰 韩雅玲 齐岩梅
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 载体 SM22α 纯化 平滑肌细胞 胚胎干细胞
• 年，卷（期）: 2009,（45）
• 所属期刊栏目: 干细胞培养与分化
• 页码范围: 8865-8870
• 页数: 6页
• 分类号: R394.2
• 字数: 6384字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2009.45.012

摘要

背景:胚胎干细胞是平滑肌细胞重要的来源之一,但是胚胎干细胞分化细胞的异质性导致难以获得较纯的平滑肌细胞.目的:为进一步纯化胚胎干细胞来源的平滑肌细胞,拟在体外构建平滑肌特异性SM22α启动子驱动的嘌呤霉素抗性(puromycin acetyltransferase,pac)基因与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因双表达载体,即pSM22-PAC-IRES2-EGFP载体,并在胚胎干细胞中检测其有效性及特异性.设计、时间及地点:基因水平细胞观察实验,于2007-05/2008-09在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成.材料:小鼠胚胎干细胞系R1购自美国ATCC公司,编号SCRC-1011~(TM).pSM22α-EGFP载体由本实验室构建;pIRES2-EGFP载体、pSM2C载体、pSuper.basic载体购自Invitrogen公司.方法:用聚合酶链反应方法从pSM22α-EGFP中扩增SM22α启动子,然后用该启动子替换pIRES2-EGFP载体中的CMV启动子,构建pSM22-IRES2-EGFP.再从pSM2C中用HindⅢ/Cla Ⅰ酶切获得pac基因,将pac基因片段亚克隆到pSuper.basic中,构建pSuper-PAC.最后BgⅢ/Acc Ⅰ双酶切pSuper-PAC获得pac基因片段,将其插入到pSM22α-IRES2-EGFP,构建成pSM22α-PAC-IRES2-EGFP.将pSM22α-PAC-IRES2-EGFP用脂质体法转染胚胎干细胞,G418筛选阳性克隆.诱导胚胎干细胞阳性克隆分化,RT-PCR扩增pac基因鉴定阳性克隆.对分化细胞行平滑肌细胞标志物SMα-actin免疫荧光染色.主要观察指标:①pSM22α-PAC-IRES2-EGFP测序结果.②pac基因扩增.③荧光显微镜下同时观察分化细胞EGFP的表达及SMα-actin染色情况.结果:HindⅢ/Cla Ⅰ双酶切得到261 bp,664 bp,5 000 bp 3个片段,与预期结果一致,测序结果证实pSM22α-PAC-IRES2-EGFP构建成功.Pac基因扩增证实有4株胚胎干细胞克隆转染成功.转染成功的胚胎干细胞被诱导分化后,部分细胞表达EGFP,且这些细胞SMα-actin染色呈阳性.结论:实验成功构建了平滑肌细胞筛选载体pSM22α-PAC-IRES2-EGFP.成功转染这一载体的胚胎干细胞表达pac基因及EGFP基因,且EGFP表达具有平滑肌特异性.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	韩雅玲	解放军沈阳军区总医院心内科	26	102	7.0	9.0
2	吴光哲	解放军第四○六医院心内科	8	39	4.0	6.0
3	田孝祥	大连医科大学研究生院	2	2	1.0	1.0
4	康建	解放军沈阳军区总医院心内科	7	19	3.0	4.0
5	闫承慧	解放军沈阳军区总医院心内科	14	33	4.0	5.0
6	齐岩梅	解放军沈阳军区总医院心内科	3	2	1.0	1.0
7	陶杰	解放军沈阳军区总医院心内科	3	3	1.0	1.0