单一引物标记LUX荧光RT-PCR鉴别BTV和EHDV

• 作者: 周晓黎 张彩虹 曹琛福 曾少灵 杨俊兴 林庆燕 花群义 阮周曦 陈兵 陶虹
• 来源期刊: 动物医学进展
• 学科: 农学
• 关键词: LUX荧光RT-PCR 蓝舌病病毒 流行性出血病病毒
• 年，卷（期）: 2010,（3）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 6-11
• 分类号: S852.659.4
• 字数: 5021字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1007-5038.2010.03.002

摘要

采用在线LUXTM专业软件,根据BTV-NS3基因序列和EHDV-NS3基因序列,通过特异性单一引物序列3'末端的荧光标记,分别设计出两对BTV和EHDV的LUX荧光PCR引物,并采用BLAST软件对各引物进行匹配性和特异性分析,根据分析结果选择合适的引物合成.经过各反应条件的优化和特异性、敏感性试验,并对BTV、EHDV、VSV、PPRV、BVDV、AKV的BHK-21细胞培养物和临床样品检测,与常规RT-PCR进行对比检测,建立了能同时鉴别检测BTV和EHDV的二重LUXTM荧光PCR方法.该二重LUXTM荧光PCR的BTV和EHDV各自引物只对相应的病毒呈阳性反应,两者没有交叉反应现象,对健康牛、羊和猪基因组DNA、BKH-21细胞对照,以及其他几种相似疾病如VSV、PPRV、BVDV、AKV均呈阴性反应.该法对病毒的细胞培养液鉴别检测敏感性可达1TCID50C以上,比常规RT-PCR敏感性提高10倍以上,从样品核酸纯化到完成二重LUXTM荧光PCR反应和熔解曲线分析,仅需3 h,在进出口动物检验检疫中快速鉴别BTV和EHDV具有实际应用价值.