中华绒螯蟹和罗氏沼虾cyclin B蛋白的原核表达、抗体制备及其鉴定

• 作者: 冯海洋 邱高峰
• 来源期刊: 中国水产科学
• 学科: 生物学
• 关键词: 中华绒螯蟹 罗氏沼虾 cyclin B多克隆抗体 原核表达 卵母细胞成熟
• 年，卷（期）: 2011,（4）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 713-719
• 分类号: Q959
• 字数: 5296字
• 语种: 中文
• DOI: 10.37241SP.J.1118.2011.00713

摘要

从中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)卵巢cDNA中克隆了cyclin B基因的开放阅读框,分别连接到pGEX-2T和pET-32a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白GST-EsCB和Trx-MrCB.通过优化培养温度、IPTG浓度以及诱导时间,得出重组蛋白的最佳表达条件分别为:0.1mmol/L IPTG、37℃、4h和0.1 mmol/L IPTG、30℃、6h.重组蛋白主要以包涵体形式存在.亲和层析纯化重组蛋白,作为抗原免疫家兔,制备GST-EsCB和Trx-MrCB多克隆抗体.ELISA检测抗体效价均高达1:80 000,Western blot鉴定该抗体能特异性识别重组蛋白,而且均能够从卵巢总蛋白中检测到cyclin B蛋白.在中华绒螯蟹未成熟卵巢中cyclin B蛋白出现2种亚型,在罗氏沼虾未成熟卵巢中只有1种亚型,推测虾和蟹cyclin B蛋白调控卵母细胞成熟的分子机制不同.本研究制备了cyclin B抗体,旨为在蛋白水平研究cyclin B在卵母细胞成熟过程中的作用机制提供基础条件.