靶向C区的小发卡RNA体外对耐药乙型肝炎病毒的抑制作用

• 作者: 任广立 张卫云 方颖 王鲜艳 白雪帆 罗爱武 许蔓春 赵树进 马恒颢
• 来源期刊: 实用儿科临床杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 乙型肝炎病毒 小干扰RNA 基因治疗 耐药 HepG2细胞
• 年，卷（期）: 2011,（22）
• 所属期刊栏目: 感染性疾病
• 页码范围: 1706-1708,1715
• 分类号: R725.7
• 字数: 3337字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1003-515X.2011.22.006

摘要

目的 评价基于载体的靶向乙型肝炎病毒(HBV)C基因的小发卡RNA(shRNA)对耐拉米夫定HBV的抑制作用,探讨新的抗病毒治疗手段.方法 从临床耐拉米夫定患儿中提取耐药HBV基因组,经高保真重复延伸及序列拼接后测序,纯化并克隆到pGEM-T Easy TA载体,再经酶切消化,连接入pcDNA3.1载体,构建表达耐药HBV的表达载体pcDNA-HBV-1；根据GenBank收录HepG2细胞系中HBV基因全序列,设计构建针对HBV C基因区的3条siRNA的表达载体pSilencer4.1/HBV-C1,C2,C3.经退火连接入pSilencer-CMV4.1载体.中量超纯提取质粒,定量后与转染试剂siPort XP-1及pcDNA-HBV-1共转染人肝癌细胞系HepG2细胞.分别设立正常HepG2组(未转染组)、载体阴性对照组及共转染组.在共转染后的不同时间点,应用Western blot检测细胞中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)蛋白、乙肝病毒e抗原(HBeAg)蛋白的表达；应用实时荧光定量PCR定量检测细胞上清中HBV DNA拷贝的变化.结果 构建的耐药HBV表达载体用于转染HepG2细胞,在转染后的第7天至下次传代前该细胞中可检测到稳定表达的HBV DNA,HBsAg、HBeAg可检出.Western blot结果:在转染的第3天载体pSilencer4.1/HBV-C1、pSilencer4.1/HBV-C2、pSilencer4.1/HBV-C3均可抑制HBV的复制与表达,其中pSilencer4.1/HBV-C2抑制效应尤其显著,在转染后第3天对HBsAg、HBeAg的抑制率分别为(83.53±0.48)％、(86.12±0.83)％.定量PCR检测显示特异性siRNA可以显著抑制HBV-DNA,可以使DNA拷贝数降低102个数量级.结论 基于载体的特异性siRNA在体外可抑制HepG2细胞中耐药HBV的复制和表达.该特异性siRNA可作为耐拉米夫定HBV的一种有效的基因治疗措施.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	赵树进	广州军区总医院药剂科	271	2349	23.0	37.0
2	马恒颢	广州军区总医院儿科	36	121	7.0	10.0
3	张卫云	广州军区总医院检验科	57	343	9.0	16.0
4	罗爱武	广州军区总医院儿科	26	172	8.0	12.0
5	许蔓春	广州军区总医院儿科	23	101	5.0	9.0
6	任广立	广州军区总医院儿科	19	110	6.0	9.0
8	王鲜艳	广州军区总医院儿科	8	66	4.0	8.0
9	方颖	广州医学院附属口腔医院修复科	20	96	5.0	8.0