基因转运载体中甲基化XbaⅠ位点的体外克隆与应用

• 作者: 于广福 于爱莲 姜世金 施鲁笛 王玉 赵英会 郭慧君
• 来源期刊: 中国病原生物学杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 甲基化XbaⅠ 重组克隆 稳定性 生物活性
• 年，卷（期）: 2012,（1）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 17-21
• 页数: 5页
• 分类号: Q78
• 语种: 中文

摘要

目的 探讨基因转运载体中甲基化XbaⅠ位点在基因克隆中的效用. 方法 以pIRES2-EGFP为母本,PCR扩增获得携附加XhoⅠ位点和满足甲基化序列组成的Xba Ⅰ位点、同时缺失IRES和EGFP区段的载体骨架p△SG,其PCR产物与携带对等酶切位点的EGFP PCR产物经酶切、连接后,构建重组质粒rp△SG-EGFPV-Xho、rp△SG-EGFPV-Xba.另将p△SG和EGFP的PCR产物分别与pMD 18-T Simple T载体连接,构建重组质粒psT-△SG和psT-EGFP,并亚克隆获得重组质粒rp△SG-sT-EGFPV-Xho.以DsRed2基因置换rp△SG-sT-EGFPV-Xho中的EGFP基因,获得重组质粒rp△SG-sT-DsRed2V-Xho.各重组质粒经脂质体介导转染CHO细胞. 结果 各重组质粒转染的细胞中明显可见EGFP或DsRed2的高效表达. 结论 PCR产物中满足甲基化序列组成的XbaⅠ位点,在体外酶切与连接的克隆效果良好；该序列经体外重组并导入Dam+和/或Dcm+宿主菌中扩增时被重新甲基化而受保护,且对重组质粒在宿主细胞内的稳定性和生物活性没有明显影响.