四环素诱导型单载体的构建、体外表达与鉴定

• 作者: 乔宪凤 华再东 华文君 周荆荣 毕延震 肖红卫 郑新民 马卓
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: pTet-on-Advanced 诱导表达载体 真核表达 猪成纤维细胞
• 年，卷（期）: 2012,（8）
• 所属期刊栏目: 研究资源
• 页码范围: 936-941
• 分类号: S852.5
• 字数: 4215字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2012.08.013

摘要

pTet-on-Advanced双载体表达系统应用于转基因动物研制,需要建立两种动物品系,经过杂交和筛选,才有可能得到转基因个体,操作繁琐,转化效率低.本研究在改良的四环素(Tet-on)基因可调控系统基础上,通过PCR的方法,分别从pTet-on-Advanced质粒和pEGFP-N1质粒中扩增rtTA和EGFP基因,测序正确后,将rtTA和EGFP基因亚克隆入pTRE-Tight载体中,构建四环素pTRE-Tight-rtTA -EGFP单载体表达系统,然后采用脂质体法,将新构建的单载体表达体系pTRE-Tight-rtTA -EGFP转染猪胎儿成纤维细胞,以不同浓度(0.0001、0.001、0.01、0.1和1g/L)强力霉素(Dox)诱导,通过荧光显微镜检测EGFP 的表达量.结果显示,转染48 h后,未加Dox无绿色荧光表达；1g/L Dos诱导可以观察到绿色荧光；Dox浓度分别为0.0001、0.001、0.01和0.1 g/L未观察到绿色荧光.表明l g/L Dox才能激发调控作用.本研究成功构建pTRE-Tight-rt TA-EGFP新型可控性真核表达载体,该载体在细胞中的表达受Dox的调控,能正常发挥作用.研究结果为转基因的定量表达提供了新的技术平台,也为将构建的单载体用于表达可控的转基因动物研究提供了重要科学依据.