慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

• 作者: 万华 周亮 曹开源 王铸 石华 邓军洪 郑少斌
• 来源期刊: 中山大学学报（医学科学版）
• 学科: 医学
• 关键词: RNA干扰 慢病毒 clusterin 肾细胞癌 786-O
• 年，卷（期）: 2012,（5）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 603-609
• 页数: 7页
• 分类号: R737.11
• 字数: 2934字
• 语种: 中文

摘要

[目的]应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖、迁移和凋亡的影响.[方法]构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株.实验分5组:CLU-RNAi-LV1 (KDl)、CLU-RNAi-LV2(KD2)、CLU-RNAi-LV3 (KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组).应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化.用细胞划痕实验、MST-1、流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖、迁移、凋亡等生物学行为的改变.[结果]成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒.Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1、KD2、KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4％～96.5％和0.Western blot结果显示KD1、KD2、KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24％、46.26％和58.91％,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达.划痕实验显示24h时KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43±25.92)小于NC组(101.35±6.05)和CON组(68.13±6.64,P＜0.05).WST-1法检测转染后72 h KD3 (si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P＜ 0.05),各组间差异(P＜0.05),均有统计学意义.流式细胞仪检测KD3 (si-CLU)组与NC组、CON组细胞凋亡率分别为(6.23±2.51)％、(1.05±0.30)％和(1.17±0.29)％,KD3 (si-CLU)组与NC组、CON组相比凋亡率增加(P＜0.05),差异有统计学意义.肾癌786-O细胞的增殖、迁移受到抑制,而凋亡率增加.[结论]筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株.CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖、迁移并促进细胞凋亡.