连续3步缺口修复构建小鼠乳清酸蛋白-人溶菌酶杂合基因座

• 作者: 吴晓洁 周艳荣 李金钢 林艳丽 熊福银 邵振鲁 郑芸芸 陈红星
• 来源期刊: 生物技术通讯
• 学科: 生物学
• 关键词: 细菌人工染色体 缺口修复 乳清酸蛋白 人溶菌酶
• 年，卷（期）: 2012,（5）
• 页码范围: 648-652
• 分类号: Q78
• 字数: 4447字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2012.05.005

摘要

目的:构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列在乳腺内特异性高效表达的mWAP-hLYZ杂合基因座,实现人溶菌酶的高效表达.方法:采用连续3步缺口修复的方法.首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂序列,构成能够连续进行3次缺口修复的基因抓捕载体.然后在大肠杆菌内利用λ噬菌体Red同源重组系统介导的同源重组方法:第一步,从含mWAP基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆8 kb的mWAP基因3'端完整侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从含hLYZ基因的BAC上亚克隆5 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLYZ基因组序列;第三步,从mWAP BAC上亚克隆9 kb的mWAP基因5'端完整侧翼序列,并使上述3个片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起.结果:构建了全长约22 kb的mWAP-hLYZ杂合基因座,经PCR扩增、限制性内切酶酶切和序列测定验证,构建的杂合基因座达到原mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)完全被hLYZ基因组序列精确置换的目的.结论:通过连续3步缺口修复构建杂合mWAP-hLYZ基因座乳腺表达载体,为乳腺生物反应器高效表达人溶菌酶提供了可行的思路和方法.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	吴晓洁	军事医学科学院生物工程研究所	15	73	5.0	7.0
2	周艳荣	军事医学科学院生物工程研究所	33	156	7.0	10.0
3	熊福银	军事医学科学院生物工程研究所	16	62	5.0	7.0
4	林艳丽	军事医学科学院生物工程研究所	19	95	5.0	9.0
5	李金钢	陕西师范大学生命科学学院	45	365	11.0	16.0
6	邵振鲁	陕西师范大学生命科学学院	1	2	1.0	1.0
7	郑芸芸	陕西师范大学生命科学学院	2	3	1.0	1.0