人LMP-1基因腺病毒重组体的构建及其在骨肉瘤细胞U2OS中的表达

• 作者: 刘会文 戴闽 曹凯 杨东 罗嘉全 詹平 韩智敏 黄路
• 来源期刊: 重庆医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: LIM矿化蛋白-1 重组腺病毒载体 表达载体构建 骨肉瘤细胞
• 年，卷（期）: 2012,（7）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 589-594
• 分类号: R738.1
• 字数: 4593字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.0253-3626.2012.07.006

摘要

目的:构建表达人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因的腺病毒重组体,体外感染骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)细胞系U2OS,并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达.方法:以K562细胞的cDNA为文库,采用PCR方法对LMP-1进行扩增,通过TA克隆与pGEM-T载体连接并DNA测序.双酶切后并将目的基因插入至腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV,对腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1行双酶切和DNA测序鉴定,并通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测pAdtrack-CMV-LMP-1在HEK-293T细胞中的表达.线性化pAdtrack-CMV-LMP-1,在BJ5183菌内完成与骨架质粒pAdeasy-1的同源重组,构建重组腺病毒质粒Ad-LMP-1.通过脂质体介导,在HEK-293A细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒Ad-LMP-1,大量扩增、纯化并测定滴度.用Ad-LMP-1感染OS细胞系U2OS,通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测LMP-1在U2OS细胞中的表达.结果:双酶切和DNA测序鉴定穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1构建成功,荧光显微镜证实转染了pAdtrack-CMV-LMP-1质粒的HEK-293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot验证了LMP-1基因的表达量明显高于对照组.通过扩增、纯化,Ad-LMP-1滴度达到1.5×109 pfu/ml.荧光显微镜下观察重组腺病毒感染的U2OS内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot检测发现重组腺病毒感染U2OS后,LMP-1的mRNA和蛋白表达量明显高于对照组.结论:成功构建了人LMP-1基因腺病毒重组体,为进一步的实验研究奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	戴闽	南昌大学第一附属医院骨科	143	943	14.0	21.0
2	曹凯	南昌大学第一附属医院骨科	33	108	6.0	8.0
3	韩智敏	南昌大学第一附属医院骨科	41	219	7.0	13.0
4	詹平	南昌大学第一附属医院骨科	18	55	4.0	6.0
5	杨东	南昌大学第一附属医院骨科	24	91	4.0	9.0
6	刘会文	南昌大学第一附属医院骨科	3	21	2.0	3.0
7	黄路	江西省妇幼保健院儿保科	6	24	3.0	4.0
8	罗嘉全	南昌大学第一附属医院骨科	4	23	2.0	4.0