大丽轮枝菌分泌蛋白提取方法比较

• 作者: 徐明 戴小枫 李蕾 桂月晶 祁伟彦 肖红利 陈捷胤
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 大丽轮枝菌 分泌蛋白 提取方法 LC-MS/MS 比较
• 年，卷（期）: 2014,（12）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 2348-2356
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.12.007

摘要

【目的】采用超滤法（UF）、三氯乙酸沉淀法（TCA）、离子交换富集法（IEX）分别从大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）高致病性菌株VdG1培养上清液中提取分泌蛋白，对提取样品进行质谱鉴定。寻找适合大丽轮枝菌分泌蛋白的提取方法，为大丽轮枝菌分泌蛋白组深入研究奠定基础。挖掘大丽轮枝菌分泌蛋白中潜在的致病相关蛋白，为其深入功能验证及致病机理研究提供平台。【方法】3种方法提取大丽轮枝菌VdG1分泌蛋白， shot-gun方法进行质谱鉴定。利用生物信息学软件WoLFPSORT、SignalP、TMHMM、PHOBIUS对其中经典分泌蛋白进行预测。通过CAZy和PHI数据库进行经典分泌蛋白中碳水化合物水解酶（CAZy）和病原菌寄主互作因子（PHI）注释，BLASTp软件进行RxLx、LysM、Cys Pattern等模体蛋白比对分析。提取的蛋白样品接种感病棉种（军棉1号）进行样品生物学活性及致病性检测。【结果】TCA法、IEX法和UF法制备大丽轮枝菌分泌蛋白，其提取效率分别为1.18、0.96和0.56 mg?L-1。SDS-PAGE电泳检测显示UF法提取的蛋白样品条带少而模糊。而TCA法和IEX法提取的蛋白样品条带较多，样品的纯度也较高；经生物信息学软件预测分析，提取的蛋白样品中含有经典分泌蛋白分别为124、112和75个；质谱鉴定的分泌蛋白中含有潜在致病因子分别为98、85和57个；另外，IEX法制备大丽轮枝菌分泌蛋白效果较好，具有小分子偏好性，且能够保持样品的生物学活性，该蛋白样品接种棉花叶片能够引起萎蔫、坏死的症状。【结论】3种方法提取大丽轮枝菌分泌蛋白，UF法提取效率最低，纯度最差，蛋白数量最少，蛋白样品中含有潜在的毒素蛋白数量也最少，而且对于大体积处理相当耗时。TCA法和IEX法都适合大丽轮枝菌分泌蛋白的制备，但是TCA法制备过程中不能保持样品的生物学活性，后续适合于2-D电泳检测等试验。IEX法首次应用于病原菌分泌蛋白的制备，操作简单、方便，全部过程均由仪器系统完成。制备的大丽轮枝菌分泌蛋白具有生物学活性，能够引起棉花叶片的萎蔫、坏死病症。另外，数据库及软件比对分析发现大丽轮枝菌分泌蛋白组中含有CAZy酶类61个、PHI相关蛋白38个、RxLx模体蛋白13个、LysM模体蛋白1个、Cys Pattern的模体蛋白15个、VdNEP蛋白家族2个。该结果将为致病相关蛋白的筛选和深入功能验证提供重要依据。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	戴小枫	中国农业科学院农产品加工研究所	75	1013	16.0	30.0
2	李蕾	中国农业科学院农产品加工研究所	24	866	11.0	24.0
3	徐明	中国农业科学院农产品加工研究所	11	146	5.0	11.0
4	桂月晶	中国农业科学院农产品加工研究所	3	24	3.0	3.0
5	祁伟彦	中国农业科学院农产品加工研究所	6	41	4.0	6.0
6	陈捷胤	中国农业科学院农产品加工研究所	16	274	8.0	16.0
7	肖红利	中国农业科学院农产品加工研究所	5	41	3.0	5.0