温泉土壤宏基因组文库构建及普鲁兰酶筛选

• 作者: 庞浩 杜丽琴 陆坚 韦宇拓 马贵 黄日波
• 来源期刊: 南方农业学报
• 关键词: 普鲁兰酶 宏基因组 16S rRNA DNA文库 温泉土壤
• 年，卷（期）: 2014,（5）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子生物学
• 页码范围: 725-730
• 页数: 6页
• 分类号: S154.3
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2014.5.725

摘要

[目的]构建温泉土壤宏基因组文库并进行普鲁兰酶活性筛选,以期获得高活力、耐高温的新型普鲁兰酶基因.[方法]采用间接法提取温泉土壤样品中宏基因组DNA,经Sephadex G200(含2％ PVPP)凝胶柱和电洗脱两步纯化后,扩增16S rRNA序列,通过序列比对和系统发育进化树分析温泉土壤微生物的多样性;然后以pCC1FOS为载体构建温泉土壤宏基因组文库,并对所获得的宏基因组文库进行活性筛选.[结果]利用宏基因组技术提取温泉土壤样品中微生物的基因组DNA,构建了一个约含1 146个克隆的温泉土壤16S rRNA文库,经遗传进化分析,发现温泉土壤样品中的大部分微生物未被研究过,主要来源于厚壁菌门(Firmicutes),其次为恐球菌—栖热菌门(Deinococcus-Thermus)和变形杆菌门(Proteobacteria).用提取获得的宏基因组DNA成功构建了温泉土壤微生物宏基因组Fosmid文库,文库约含2.7万个克隆,平均插入片段长度为40.0 kb,文库外源DNA总容量为1.2×109bp;通过活性筛选共获得9个可表达普鲁兰酶活性的克隆.[结论]宏基因组文库技术是获取极端环境微生物新酶的有效手段,可为进一步挖掘普鲁兰酶的应用潜力及研究其耐热机理奠定基础.