基于理性设计的β-甘露聚糖酶底物亲和力的定向改造

• 作者: 李剑芳 王春娟 赵梅 邬敏辰 魏喜换
• 来源期刊: 浙江大学学报（农业与生命科学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: β-甘露聚糖酶 底物亲和力 定向改造 理性设计 定点突变
• 年，卷（期）: 2014,（1）
• 所属期刊栏目: 食品科学(Food sciences)
• 页码范围: 58-74
• 页数: 17页
• 分类号: Q556+.2
• 字数: 12229字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3785/j.issn.1008-9209.2013.06.011

摘要

以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)为研究对象，对其底物亲和力的定向改造进行理性设计及定点突变以获取米氏常数 Km 值较低的突变酶AuMan5AY111F .首先采用同源建模和分子对接模拟等方法预测AuMan5A与甘露二糖对接复合物的空间结构；在此结构上使用PyMol软件统计到距甘露二糖8?以内的38个氨基酸位点.其次对不同来源的、与AuMan5A一级结构序列全同率大于50％的β-甘露聚糖酶进行多序列比对；排除21个保守氨基酸位点，依据17个非保守位点上的氨基酸性质及其所处空间位置，选择AuMan5A中的Tyr111、Phe206和Tyr243作为拟突变氨基酸，将它们分别替换为性质相似的或在其他β-甘露聚糖酶序列中出现频率高的氨基酸，形成一系列拟突变酶.最后采用MM-PBSA法计算 AuMan5A及其拟突变酶与甘露二糖的结合自由能(ΔGbind )，其中AuMan5AY111F的ΔGbind为-237.7 kJ/mol ，较其他酶的ΔGbind均低.基于该理性设计采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Tyr111的密码子TAC突变为编码Phe111的TTC ，构建出突变酶基因( A uman5A Y111F ).分别将 A uman5A Y111F和 A uman5A 在毕赤酵母GS115中进行表达，并对重组表达产物reAuMan5AY111F和reAuMan5A进行分离纯化和动力学常数测定.结果表明：reAuMan5AY111F对瓜尔豆胶的 Km 值由突变前的3.9 mg/mL降低为2.5 mg/mL ；而突变前后酶的Vmax值变化不大.该研究运用多种生物信息学软件对提高AuMan5A底物亲和力进行了理性设计，并通过定点突变证实之，这为β-甘露聚糖酶乃至其他各种酶底物亲和力的定向改造提供了新的技术策略.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	邬敏辰	江南大学无锡医学院	163	1504	22.0	29.0
2	李剑芳	江南大学食品学院	52	513	12.0	21.0
3	赵梅	江南大学食品学院	5	55	4.0	5.0
4	魏喜换	江南大学食品学院	4	24	3.0	4.0
5	王春娟	江南大学食品学院	9	33	3.0	5.0